光照对大小鼠繁育性能影响的研究进展

吴宪文 陈 烨 徐国恒,2

(北京大学医学部1.实验动物科学部;2.基础医学院生理学与病理生理学系,北京 100191)

光照是动物设施中需要考虑的一个关键因素,光不仅支持着动物对周围环境的认知及活动,同时也对体内激素平衡、神经反应、昼夜节律及繁殖等调节具有重要影响[1]。光照过强易导致动物视觉损伤,雌鼠作窝差,有时出现哺乳不良甚至吃仔,导致仔鼠成活率低,而光照过弱则动物性周期不稳定[2-3]。因此动物饲养室内的光照环境是动物饲养和研究中的一个重要变量,科学家和设施管理人员都需要了解光照对实验动物的影响,以改善动物饲养设施和实验室设施的照明,使动物处于最佳健康与生殖状态,利于动物福利。实验大小鼠是生物医学研究的常用动物,有报道称小鼠和大鼠约占美国生物医学研究动物的95%[4]。本文综述了光照对不同品系大小鼠繁殖性能的影响,对大小鼠饲养设施的光照方式进行思考讨论和展望。

1 大小鼠设施光照要求及现状

NIH《实验室动物护理和使用指南》(第八版)建议,距地面约1 m的光照度约400 Lx,一般已足够应用于动物的饲养管理,且不会引起白化大鼠的光毒性视网膜病的临床症状[5]。≥500 Lx时则会引起 SD 大鼠视网膜光损伤[6]。日本实验动物设施标准规定,在室内中央距地面40～85 cm处光强度为150～300 Lx[2]。这些与国内的光照标准有所不同,目前中国国家标准规定大小鼠生产间和实验间的工作光照强度以≥200 Lx为宜,动物照度为15～20 Lx。中国各地方标准与国标基本相同。通常动物操作人员工作时开工作照明,工作结束后只留动物照明,因此国内实验动物在明周期内所处的光照环境实际上一半为工作照明的强度即≥200 Lx,一半为动物照明的强度即15～20 Lx,或两种强度时间比例不确定。国标对于光照节律的规定为12 h明/12 h暗或10 h明/14 h暗,而Jackson实验室的操作指南中推荐光照节律为14 h明/10 h暗[7],它们认为这对动物发情是有利的。目前国内多数实验动物设施设置的光照节律为12 h明/12 h暗,关于节律与动物繁殖性状的关系未见到更多的不同结论。不同的饲养环境及设施条件会对相同品系的实验动物产生不同的影响。有许多因素可影响动物对光照的需求,在确定室内饲养动物照明水平时应当注意这些因素,其中包括光照度、光线波长、光照时间、动物的光照经历、动物的体表色泽、昼夜节律、动物的体温、激素水平、年龄、种类、性别和品系等[5]。很可能光照、食物、水以及温度等因素都影响实验动物大小鼠的繁殖,但在这些变量中光照条件最难控制,也最容易被忽视。

2 光照时间及昼夜节律对大小鼠繁殖的影响

哺乳动物的生理和行为都受到下丘脑视交叉上核相关的中枢及外部生物钟控制系统调节,该系统是由视网膜感知光信号从而调节昼夜节律,昼夜节律时钟系统整合到下丘脑-垂体-性腺轴中,调节激素基因表达、激素分泌以及生殖系统中的生物节律[8-9]。松果体分泌的褪黑素(melatonin)在该过程中起到关键的作用,褪黑素的分泌呈昼夜变化,暗周期中分泌较多,作用于下丘脑并抑制垂体释放促性腺激素。光周期中褪黑素分泌少,可促进促性腺激素的分泌[10-11]。许多野生动物、家养动物及实验动物,都是季节性繁殖动物,这意味着它们的繁殖状态取决于光照的持续时间以及由此产生的褪黑素[12]。然而,实验小鼠的繁殖状态不会随着日照长度的变化而出现季节性变化[13],有研究指出野生小鼠和一些野生来源的近交系小鼠的松果体中有褪黑素,但一些实验室小鼠的近交系(例如C57BL/6J)的松果体中检测不到褪黑素。遗传分析表明,C57BL/6J小鼠的褪黑激素缺乏是由两个独立分离的常染色体隐性基因n-乙酰转移酶(NAT)和羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)突变引起的,经检测C57BL/6J小鼠的松果体中这两种酶活性均缺失[14]。随后Goto等[15]对 36个近交品系小鼠的研究表明,除CBA/Ms、C3H/He、Mol-A、Mol-Nis、MOM 5个近交品系的松果体褪黑素含量夜间高,白天低,其他31个品系包括BALB/c和C57BL/6J均缺乏褪黑素。即便如此,光照仍然可以影响这些动物的昼夜节律及繁殖相关性状,昼夜节律紊乱的老鼠能够有规律的交配周期,但是其中一些是不育的(如BMAL1 KO小鼠)[16],这就是说对于多数近交系小鼠而言光照不能直接通过影响褪黑素的分泌调节其生殖,但能够通过影响昼夜节律而间接影响其繁殖性能。

不同品系的大小鼠对于光照长度也有不同的适应性,有研究指出半屏障系统内每天给予KM小鼠14 h 光照,其体质量和部分生殖器官重量以及雌鼠繁殖能力都明显高于10 h 光照组。也有数据显示8和12 h光照长度裸鼠的平均育成率和离乳育成率均高于16 h光照组,而不同的光照长度对裸鼠生长发育无显著影响,因此作者认为中光照和短光照更加适合裸鼠的繁育[17]。而对大鼠的研究则显示,神经系统完好的SD大鼠(30～110日龄)暴露在8 h/d和16 h/d的光照下,其生殖系统、交配行为和后代数量不受光照暴露时间的影响,但短光照组大鼠的体质量、睾丸、精囊重量及血浆睾酮水平显著降低[18],这表明过短的光照可能影响大鼠的生长发育。对于长期饲养的种群来说,这也可能影响后续的生殖器官等性状的遗传,不利于种群的质量保持。也就是说实验大鼠在合适的光照周期条件下才能具有最佳的生殖能力和种群延续。

因此在动物繁育设施中有条件做到不同品系分开不同的房间饲养时,可以将房间的照明节律按照不同品系的最适节律来进行调整,以保证繁育的最佳状态。而在实验设施中通常很难做到某个房间只放置单一品系的实验大小鼠,但可考虑设置遮挡帘布等用于分区饲养,当然这可能会增加劳动和照明设置的复杂度,不过分区饲养是值得尝试的方法。

3 光线波长对大小鼠繁殖的影响

小鼠视网膜包含三种视觉色素:杆状视蛋白,最大灵敏度为498 nm;中波长视蛋白,最大灵敏度为508 nm;紫外视蛋白,最大灵敏度约为360 nm,因此小鼠对紫外线更加敏感,对600 nm的红光不太敏感,但这并不意味着老鼠不能探测到这样的光,在红光足够明亮的条件下,老鼠依然能够对这种长波长的刺激做出反应[19]。目前,动物设施的照明已从荧光灯为主过渡到固态LED照明,LED照明的优势在于其节能、产热少,而且不需要频繁更换灯泡[6],其光谱更多的出现在可见光谱的蓝色部分(波长465～485 nm)[1]。动物内在光敏性视网膜神经节细胞(ipRGCs)暴露在波长约480 nm的蓝光下反应最大,而对长波长的红色光反应最小[20-21],并且动物设施中所使用的光的波长也会影响动物的生理变化和生物节律。研究者发现大鼠在蓝色的鼠笼中暴露于冷白色荧光(与透明的鼠笼相比)后,夜间血液褪黑素水平的峰值振幅要高出6倍以上,且对动物的健康与福利相关参数有积极影响[22]。也有研究表明近交系小鼠在红色光谱,光照强度15 Lx,光周期12 h明/12 h暗环境下,受孕率提高20%左右[23]。这样看来一些特殊的光线波长设置对大小鼠的繁殖性能是有利的,如果要将这些实验结果应用于实际生产中,可能还需要精准的时间和条件控制以及多方面的因素考虑,但值得思考的是,这样生产出的实验动物再用于节律相关实验和光感实验时是否会对实验结果有较大的影响。实验动物终归是为了服务于实验,其繁育性能的提升固然重要,但其自身的固有属性、特点及稳定性应该是更为重要的。

目前认为在大小鼠围产期夜间消除所有光照对动物福利和实验数据以及繁育单位所关注的繁殖指标较好且易于操作,但对于研究人员来说有时会不可避免的在暗周期进行实验,或者繁育设施有些也会进行夜间巡查,这种情况下利用昏暗的红光可能是维持实验动物昼夜节律的有效选择,因此目前在动物设施的建造设计中通常会安装红光灯,然而我们也应意识到,红色的灯泡并不一定只发出红色光谱中的光,因此,在动物设施使用之前,应先用光度计确定各种光源的光谱。

4 其他因素对大小鼠繁殖的影响

首先,许多光污染可能对大小鼠的繁殖性能产生影响,研究表明在动物的暗周期有必要保持绝对的黑暗,虽然老鼠的视力极差,但仅仅0.2 Lx的光照即可以改变其昼夜节律[24]。啮齿动物通常在夜间繁殖,正常的昼夜节律和褪黑激素信号可以保证较高的群体繁殖力[4]。而夜间暴露在光照下(即使是昏暗的光线)可以改变啮齿动物夜间活动的时间,并将觅食的时间转移到白天。长时间夜间光污染可造成雌性大鼠发情周期紊乱、雄激素分泌、卵泡发育及排卵异常[25]。急性光照会显著增加皮质酮水平[26],从而增加动物压力水平,而孕鼠受到压力事件刺激会导致仔鼠出生体质量偏低,繁殖力下降[28]。在实际生产中大家可能会忽略许多常见的光污染,如电源指示灯、通风设备控制屏上的灯、生物安全柜的显示屏以及小型电子设备等。目前国产多个品牌IVC设备在使用期间工作人员未操作时能够保持屏幕休眠状态,这是很好的设计及解决方式,而对于上述的其他小光源来说,用简单的物理遮挡都可实现。此外,动物饲养室通常设有观察窗,目前国内一些设施使用红膜进行遮挡,这能够很大程度上减少走廊光线对动物的影响,但仍无法完全避免走廊照明带来的光污染,对此,有研究[28]认为可以将房间设计一个前厅或者在室外门外安装了一个遮光帘,均可将光污染降低到无法检测到的水平。可以显著减少黑暗周期中的光污染。

另外,异常的明暗周期特别是极端的异常情况如持续光照、持续黑暗或者明暗周期反转,可导致孕鼠体质量增长较缓慢,仔鼠体质量较轻,孕鼠早产、并影响小鼠卵母细胞的成熟和激活能力[29-30]。持续的黑暗条件可抑制大鼠的生殖过程使卵巢重量减轻,持续光照则导致大小鼠出现永久性阴道角化,多数卵泡达到排卵前期但不形成黄体[3]。大鼠在妊娠期暴露在持续的光线下会损害成年期雄性后代的生殖系统,发生睾丸组织病理学损伤和体视学改变[31]。因此实验或繁育设施内应尽量避免异常光照周期、急性光照以及不必要的光污染。

此外笼子的放置位置及笼子的材料也会对动物接收到的光照产生较大影响,有研究认为顶层笼子的光照是底层笼子的3～19倍[32],这是较大的差异,在慢性毒性研究中由于笼子位置的不同,BALB/c小鼠和Fischer 344大鼠视网膜病变的产生显著差异[33-34]。KM小鼠在SPF环境的繁殖群中透明盒开放式饲养,其产仔数、离乳数及乳鼠成活率均高于琥珀色IVC笼具饲养的个体,其原因可能跟IVC光照不足密切相关,具体原因包括琥珀色笼盒的透光度低、高压次数增加导致笼盒透明度降低、多层叠加降低透光度以及盒盖遮挡水瓶饲料添加遮挡等[35]。这些研究表明,笼子的位置可以显著影响动物数据,在研究中应考虑到这一因素[4]。同时不同颜色的标准鼠笼的光谱透射率显著影响大小鼠的昼夜节律、生理、代谢和生殖[36-38]。

因此,实验动物设施建造及动物饲养时也应同时考虑到光污染、笼子位置及笼盒颜色等情况,实验动物设施负责人及科研员应掌握准确的光照数据,包括不同层的笼子内部光照强度,因为不同品牌和型号IVC笼盒材质和颜色也不尽相同,为了稳定的控制管理光照,建议同一设施最好采购同一品牌的同一材质笼盒,并在笼盒老化后及时更换新笼盒或者增加光照。

5 大小鼠设施光照设置的思考及展望

随着科学的进展,人们不断发现以前没有意识到的一些实验变异来源,可能影响实验结果的可重复性[39]。许多研究论文没有提供任何关于动物设施照明数据,只是暗示在默认范围内,然而现实中不同国家、地域、机构等默认的光照度指导规范却不尽相同,相信这也对很多实验的可重复性带来了一定的困难,尤其是神经及内分泌相关的研究。而对于大小鼠繁育机构,相互间的交流度较低,对于群体繁育数据的影响因素分析及论文较为少见,这对于提升大小鼠饲养繁殖质量、效率及解决工作中的问题是不利的。因此建议:①国家及地方标准对于光照的要求中增加更多不同品种和品系的细节规定及研究数据;②繁育单位间增加技术交流,重视群体数据的分析及发表;③研究人员在今后的论文撰写中标明动物设施的光照设置,这样也会增加结果的可重复性。

针对目前设施都会涉及到的光照分布不均匀问题,有繁育人员提出可把IVC笼架设计成“阶梯型”[35]。在空间充足的情况下这是很好的建议,但实际生产中的大部分地区设施空间有限,因此对该设计也存在一定的限制性。国产某品牌的EVC笼架沿着架子纵向设置了氛围灯,并且会不停的变色,这种在架子上添加纵向光照的设计确实是改善光源平均分布的好办法,但不停变色的设计可能并不一定能对大小鼠起到积极的作用,这种方案的应用可能还需要进一步的实验验证。我们认为对于底层笼架光照较低的问题可以在动物设施设计之初让专业人员设计墙壁上及地面上的灯带,同时降低单一来自头顶的光源强度,使整个房间光线分布均匀。对于已建造好的设施可以在两个IVC笼架间或者地面上增加几处可移动光源来补充低层笼架光照的不足,但这样的补充可能也会带来一定的麻烦,如占用工作空间以及增加了房间热源,需重新调整空调温度等,这可能需要多次实验及验证工作才能用于设施运行,不过这是补充光源最简便的思路。

无论是动物实验设施还是繁育设施,除必要的物理环境外对动物带来较大影响的应是工作人员,因此对工作人员的培训和教育、制订明确的光照度操作规程很重要,要认识到突然开灯对动物带来的损害以及对动物繁殖的干扰,饲养及技术人员应尽量在动物的光周期内完成相应的工作,在工作结束后遮挡多余光源。改善光照条件,合理分布光源,提高工作人员对光照的知识,有利于提升动物健康、生殖及福利。关于照明对实验动物视觉影响的研究有些已经较深入,但如何改善设施建设,控制照明平均分布以及照明对实验动物生长繁殖的影响,还需更多的研究与实践验证。