胰腺癌生物模型的应用现状与展望*

徐 冬 杨 飞

(南京市高淳人民医院 1.普外科,2.大内科,南京 211300)

胰腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)将在2030年跃居全球癌症发病率第二位,其发病隐匿、易早期转移的特点使患者在就诊时常处于中晚病期而失去根治性手术机会,虽然包括FOLFIRINOX等方案在内的综合治疗使PDAC患者的5年生存率由6%升至10%,但整体预后仍然很差[1-2],研究其发生发展的分子机制对PDAC诊疗具有重要意义。PDAC的生物学特点使临床医生很难在根治性手术前提下、完整获取不同分期的病灶以验证通过各种组学方法筛选的某些新靶点的生物学功能。因此,亟需一种可同时助力PDAC发生发展、转移、复发等机制研究,并用以探索新治疗手段的生物模型。理想的PDAC模型需具备以下特点[3]:(1)具有与人源PDAC相似的生物发展过程且稳定可重复。(2)具备诸如免疫逃逸、侵袭、转移、神经侵犯等恶性表型。(3)模型构建效率高、成本低、周期短、可量产。而目前用于PDAC研究的诸如自发诱导模型、移植瘤模型、类器官模型以及大动物模型,虽然可重现PDAC的某些病理过程,但仍不能完整模拟PDAC的生物学变化,优势与弊端并存[3]。本文综述了上述各类生物模型的应用现状,以期为PDAC研究的模型选择提供参考。

1 诱导模型

诱导模型,指使用化学或基因技术诱导实验动物产生类似人源结构的特定肿瘤,且该肿瘤的研究结果与人源肿瘤高度类似。由于构建该模型监测时间长、花费高、成功率不一,且无法在短期内获得大量的肿瘤组织,限制了其应用。

1.1 化学诱导

Wilson等[4]于1941年首次发现,白化大鼠在长期食用添加2-乙酰胺氟的食物后出现胰腺癌,组织学呈现腺瘤及腺泡细胞癌,而无导管样结构。在1974年由Pour等成功构建首个类似人PDAC的啮齿类动物诱导模型,即连续接受含2,2’-二羟基-二-N-丙基亚硝胺(DIPN)喂食的叙利亚金黄仓鼠出现可侵犯神经并具有肝、肺、淋巴结转移倾向的胰腺癌,同时出现诸如体质量减轻、黄疸、腹水和血栓形成等症状,另外还合并第12密码子的KRAS点突变(G12D)以及抑癌基因CDKN2A的缺失和异常甲基化,但无抑癌基因Trp53突变[5]。亦有研究报道,N-亚硝基双(2-氧丙基)胺(BOP)特异性诱发仓鼠胰腺癌但机制不明,而对豚鼠、兔子等动物无致瘤作用,BOP模型除了具有DIPN模型的特征之外,还可检测到糖耐量异常以及CA125、EGFR等血清抗原的异常表达[6-7],组织分析发现BOP诱导的仓鼠胰腺导管损伤起源于异常增殖的导管细胞,而不是去分化的腺泡细胞[8]。目前,已有包括重氮丝氨酸、氯贝特等在内的16种化合物可以诱导鼠类胰腺癌发生,同时还发现在使用不同类型化合物诱导后,鼠类主要发生无导管结构的胰腺腺泡型肿瘤,而对豚鼠化学诱导的胰腺癌组织分析显示,PDAC主要经由腺泡-导管化生(acinar-to-ductal metaplasia, ADM)的病理生理学过程发展而来[9]。化学诱导的仓鼠模型,可以帮助识别已知的和新出现的人PDAC危险因素并指导针对性干预措施的实施,但致癌化合物特异性差,在诱导PDAC的同时也可能诱发其他腹腔器官肿瘤,限制了其应用。

1.2 基因工程诱导

正常胰腺上皮发生癌变与癌基因KRASG12D的激活,及其与抑癌基因CDKN2A、Trp53、Smad4、BRCA2等失活之间的协同作用密切相关。有研究于2003年利用弹性蛋白酶启动子介导,首次成功构建并证实单独的KRASG12D突变可诱导正常胰腺导管发生非侵袭性癌前病变,即上皮内瘤变(PanINs),但不会导致侵袭性癌变的小鼠模型[10]。后经Brembeck FH通过细胞角蛋白19(CK19)报告基因实验证实KRASG12D突变诱导的胰腺导管样病变可能通过ADM发生并伴随病灶周围淋巴细胞浸润,靶向抑制KRASG12D表达后小鼠未出现PanINs[10]。基于KRASG12D在PDAC发生中发挥的驱动作用,结合条件基因打靶技术(即Cre-Loxp技术)经靶向胰腺的组织特异性启动子介导将癌基因导入小鼠胚胎或体细胞后诱发胰腺癌,即为基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse models, GEMMs)[11],常见种类包括[10,12-15]:①KC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre)模型:致瘤缓慢,可出现正常胰腺组织-ADM-PanINs的病理过程,具备发展为PDAC倾向,主要用于胰腺癌早期发生和预防方面的研究。②KPC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,LSL-Trp53R172H或CDKN2Alox/lox)模型:致瘤迅速,可出现正常胰腺组织-PDAC-侵袭转移的病理过程,被周围基质包绕的瘤体血供丰富且对吉西他滨耐药,主要用于PDAC发生发展、转移、耐药等方面的研究,目前被认为是研究PDAC发生发展分子机制的动物模型金标准。③KIC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,CDKN2A/Arflox/lox)模型:亦可出现正常胰腺组织-PanINs-PDAC-侵袭转移的病理过程,但肿瘤进展比KPC模型更快,用途同KPC模型。④KD(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,Smad4lox/lox)模型:可缓慢形成胰腺导管内乳头状黏液肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN),用以研究IPMN发生发展及逐步癌变的分子机制。⑤其他模型:比如PRF1a-Cre,LSL-KRASG12D,TGFBR2lox/lox模型的瘤体组织结构类似人PDAC,用以研究转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路对PDAC发展的作用机制,Nestin-Cre,LSL-KRASG12D模型,由于肿瘤侵犯神经,该模型小鼠生存期较短,用以研究胰腺炎加速PDAC发生发展的分子机制。

另外,亦有非依赖KRASG12D突变的GEMMs报道。有研究利用大鼠弹性蛋白-1启动子介导、在小鼠体内表达致癌猿猴病毒40T抗原后出现胰腺腺泡发育不良,成年后发展为肿瘤,生存期约为4至6个月[16]。还有研究基于抑癌基因PTEN失活构建的Pdx1-CreERTM; PTENlox/lox模型在3周龄时出现ADM,并在11周龄时出现PDAC[17]。

GEMMs虽可模拟人源PDAC发生发展、侵袭转移、耐药等病理过程,并确定治疗效果,但也有其弊端:①建模时间不可控、成本高、难以量产。②难以鉴定GEMMs与人源PDAC的同源程度,不能完全理想化诠释PDAC的发生发展机制。③在建模过程中,可能会引入新的未知突变。

2 移植瘤模型

移植瘤模型是指将PDAC细胞系或人源PDAC原代细胞、组织接种于免疫缺陷鼠(裸鼠或SCID鼠)体内所形成的荷瘤动物模型。按接种部位分为原位移植、异位移植;按移植物来源分为同种移植和异种移植,后者根据移植物种类分为人源肿瘤细胞移植模型和人源肿瘤组织移植模型(patient-derived tumor xenografts, PDX)[18]。

有研究于1963年构建了首例胰腺癌细胞系[19],在使用PDAC细胞系构建原位/异位模型之前,需充分了解拟选择的细胞系的临床背景,生长特性,黏附、侵袭、转移等表型特征以及基因突变类型[3],比如:①在迁移能力方面,细胞系PANC-1是BxPc-3的5倍。②在成瘤能力方面,由强到弱的细胞系为Mia PaCa-2>Capan-1>PANC-1。③在转移倾向方面,细胞系CFPAC-1、Capan-1易肝转移,SW1990易脾转移,Colo357、Hs766T易淋巴转移,Capan-1/2易神经侵犯。随着不同PDAC细胞系广泛用于建立移植瘤模型,研究者发现其优势包括易获取、增殖周期短、可重复性高、成瘤迅速,同时发现随着传代次数增加出现的遗传漂变,移植瘤周围缺少典型的人源肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)以及无法代表人源PDAC的初期状态和病变特征亦是其弊端[20]。

2.1 异位移植模型

异位移植是指将体外培养的PDAC细胞系或人源PDAC原代细胞接种于免疫缺陷鼠的腹背或腹股沟皮下(subcutaneous, SC)产生的移植瘤模型,具有操作方便、高效、可重复性高,并可直观的监测移植瘤的生长情况的优势,但该移植瘤仅限于皮下生长,无远处转移及内脏器官侵犯能力,无法真实反映PDAC的肿瘤微环境,因此仅用以评估肿瘤对抗体或细胞药物等特定药物的反应情况,尚不适合分子机制研究[21-22]。PDAC细胞悬液的异位移植还能构建转移性模型用以研究PDAC的转移机制[3],比如:①脾静脉或肝包膜下注射构建肝转移模型。②尾静脉注射构建肺转移模型。③鼠爪注射构建淋巴转移模型。④将人体腹腔干或肠系膜上动脉表面神经组织移植在皮下,4周后在紧贴移植部位皮下注射癌细胞悬液的方法构建神经侵犯模型。

2.2 原位移植模型

又名同位移植(orthotopic transplantation, OT),是指将体外培养的PDAC细胞接种于裸鼠胰腺后成瘤,自1980年开始被广泛应用,目前常用的接种方式包括[3]:①裸鼠胰腺包膜下注射细胞悬液,但可能因注射部位癌细胞渗漏导致腹腔种植转移。②裸鼠皮下注射PDAC细胞悬液培养4周成瘤后,切除瘤体切割成1～2 mm3组织块再接种于裸鼠胰尾包膜下。③将PDAC细胞悬液注射入热敏生物凝胶,待其成瘤后再接种于裸鼠胰尾包膜下,胶体的黏附特性可防止癌细胞脱落。与SC模型相比,OT模型移植瘤的TME类似人源PDAC,并且瘤体在裸鼠体内自然生长,据此可进行生存率的模型研究[23]。但构建OT模型需严格的无菌操作和精细的外科切开缝合技术,术后也可能因切口感染、裂开,缝合胰腺胞膜所用缝线引起的局部炎性反应等并发症导致建模失败[24]。

2.3 PDX移植模型

是指将人源PDAC组织植入免疫缺陷鼠的胰腺,保留的人源TME能在移植初始(10代以内)模拟人体内的药物传递状态,并真实反应人源PDAC的组织学和遗传学特征,鉴于能在普通SPF级动物实验室制备的优势,被应用于PDAC临床前研究[25]。在PDAC肿瘤标志物鉴定方面,有研究于2006年首次利用PDX模型发现高表达脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, DCK)的PDCA对吉西他滨(gemcitabine, GEM)化疗敏感性较高,后续还发现低表达Smad4且PDX建模成功的PDAC原宿主(患者)的生存期较短[26-27]。有研究通过放射性标记发现,丙酮酸向乳酸转化增加的PDAC增殖较快[28]。在临床前药物评估方面,还有研究首次利用PDX模型发现与GEM单药化疗相比,球状激酶1(Polo-like kinase 1, PLK-1)抑制剂利戈塞替布与GEM的联合用药可降低PDAC对GEM的耐药性并进一步促进PDAC退缩,说明利戈塞替布可作为潜在的GEM增敏剂[29]。研究发现,PLK-4抑制剂CFI-400945能降低PDAC增殖标志物Ki-67的表达,抑制增殖并延长PDX模型的生存时间[30],说明CFI-400945具有潜在应用价值。在精准医学和临床相关性研究方面,研究表明入组了包括4例PDAC在内的14例实体肿瘤患者,利用63种具有抗癌活性的化合物、搭配成232种组合后给药于构建的14例PDX模型,除了1例患者在研究结果明确前死亡之外,其余13例患者均接受了PDX模型预测的最有效的药物治疗,其中有11例患者接受了17种药物组合后发现15种组合可出现肿瘤负荷持续缓解;而且针对PDAC患者,筛选了15种单药和7种组合药用于后续的临床实验[31]。有研究在一例已确诊对GEM耐药患者的PDX模型中发现肿瘤对丝裂霉素C和顺铂敏感,给予该患者丝裂霉素C单药治疗后其无进展生存期(progression-free survival, PFS)达到22个月,由于肾毒性影响,将丝裂霉素C更换为顺铂后,患者PFS又延长了36个月[32]。以上两项代表性研究说明,PDX模型可助力肿瘤精准治疗的发展。

另外,PDX模型亦有其弊端[33-34]:①该模型是已确定的人源PDAC衍生物,不适合研究在正常组织稳态和疾病起始中的基因突变和分子机制。②该模型建立在免疫缺陷鼠体内,不能反应人源免疫系统对PDAC发生发展的影响。③随着PDX传代次数增加,PDAC组织可能会出现遗传漂变,导致无法与人源PDAC基因组同质化分析,并且移植的PDAC组织内的人源TME逐渐被宿主TME取代,无法反应人源TME对PDAC进展的影响。④人-鼠之间的分子受体、配体不相容,致使移植的PDAC组织在宿主体内无法重现其在人体内的某些分子生物学过程。⑤成瘤缓慢且移植成功率高低不一。

3 类器官模型

体外培养胰腺器官可追溯至1938年,有研究通过冲淋法体外培养鼠源胰腺组织达4周[35]。自1980年开始,探索如何体外培养3D结构胰腺组织的研究者渐多[36],其中利用琼脂糖培养基将切取的人源PDAC组织在体外培养长达6 d并用于评估基因治疗效果开启了PDAC类器官研究的浪潮[37]。直至2015年,有研究首次利用基质胶成功构建了人源PDAC细胞的类器官(patient-derived organoids, PDO),并将其原位移植于免疫缺陷鼠体内,产生类似癌前病变并进展为侵袭性癌变伴转移的效果[38]。目前,PDO是指将手术切除的PDAC标本或活检组织,在细胞类型、基质胶、生长因子及信号传导四方面条件均具备情况下,培养出的保留PDAC组织学和遗传学特征的3D培养物[39],且已有研究证实处于各个病期的PDAC均可培养出相应的PDO[40]。由于PDO在精准捕获不同患者的PDAC异质性、培养的个体化迷你模型可以高效的移植入免疫缺陷鼠、精准反馈患者对药物的敏感性以及该敏感性评估结果可在PDX模型中复现这四方面的优势,使其已用于PDAC发生发展机制及TME特征研究,以及作为“试验台”对某些治疗方案进行临床前效果评估,并为精准的个体化治疗提供数据指导,缩短临床前研究与临床实验的时间窗[38,41]。虽然PDO具有显著优势,但也不可忽视其弊端:①PDO缺乏TME中的神经、血管、免疫细胞等成分,限制了该模型的应用广度。②培养PDO使用的基质胶并不能完全复制体内的TME,且会影响药效评估时的药物渗透。③PDO培养所使用的生长因子等试剂可能诱发细胞基因组变异,影响研究结果。④PDO花费高,培养周期长,培养成功率低。

4 大动物模型

虽然PDO的发展提高了PDAC临床前研究结果的可靠性,但绝大多数的模型研究还是以啮齿鼠类为主,由于鼠类体型偏小导致某些针对介入或外科技术无法按照设想落实研究。因此,为了研究某种具备治疗潜力但无法在鼠类模型验证其功效的技术或方法,以及为了获得一种高效的在临床实验之前用于评估某新型抗癌药的临床前研究平台,诸如灵长类、犬类或猪等动物模型便进入研究视野[42]。非人灵长类最“像人类”,但涉及的社会和伦理问题极大限制了其应用[43]。虽然犬类在研究诸如乳腺癌、淋巴瘤等年龄相关性肿瘤方面发挥了重要作用,但它作为人类的动物伴侣以及涉及的伦理问题,亦限制了应用[44]。

目前,猪模型已用于创伤、伤口愈合、动脉粥样硬化、囊性纤维化、杜氏肌营养不良、共济失调性毛细血管扩张症、脏器移植、肿瘤等方面的研究[45-48],与其他动物模型相比,猪模型具有以下优势:①与小鼠-人类的同源率(60%～70%)相比,猪在基因组、表观遗传学、生理学、代谢组学和免疫学特征方面与人类具有更大的相似性(80%～90%),可用以研究肿瘤早期发病时的相关分子机制[49]。②猪的体型大小与人类相似,可用以研究某些在鼠类模型上无法使用的新诊断仪器(如影像定位、荧光监测)、治疗设备(如手术器械)和技术(如导管介入、放化疗)[50-51]。③猪的血容量丰富,可在肿瘤进展的不同阶段多次采血研究肿瘤标志物的动态变化,甚至可将外周血中的免疫细胞功能化处理(如CAR-T治疗)后再回输入猪体内验证细胞免疫治疗的疗效[52]。基于以上优势,猪模型目前已成为大动物模型的首选。受GEMMs的启发,Hingorani 等于2012年构建了首例类似KPC小鼠的KRASG12D; Trp53R167H双突变转基因迷你猪模型(oncopig cancer model, OCM),且OCM体内的任何细胞经重组酶(Cre)诱导后均可产生KRASG12D; Trp53R167H双突变[15]。有研究于2015年利用Cre腺病毒(AdCre)体外诱导OCM的成纤维细胞产生KRASG12D; Trp53R167H双突变后,发现其增殖周期缩短并具备了促进肿瘤细胞迁移及菌落形成的致瘤倾向,将该细胞注射入免疫缺陷鼠后可局部促瘤形成;同时,该促瘤特性在OCM的皮下和肌肉注射时也得到了复现。研究发现[53]:①将OCM来源的胰腺导管上皮细胞经AdCre体外诱导后,出现转化表型及KRASG12D; Trp53R167H双突变,再将这些细胞皮下移植到SCID鼠后形成组织学类似人源PDAC的瘤体。②将AdCre注射入OCM主胰管约12个月后,逐渐出现组织形态(致密的癌周围基质成分)类似人源PDAC的胰腺癌结节。但注射过程需严格无菌操作,避免因局部感染导致多形性肿瘤而降低了OCM-临床相关性。③OCM具有完整的免疫系统,能够产生类似于人类的抗肿瘤免疫反应方便免疫治疗研究。该研究也暴露了OCM的弊端:OCM是否具有普适性;如何质控AdCre的操作流程和生物安全性;GEMMs操作所用的试剂和分子工具是否适合OCM;成瘤周期长、体型大、饲养成本高。

5 其他

斑马鱼与人类祖先的差异进化已超过3亿年,但两者在某些肿瘤信号通路和调控分子方面高度同源,转基因斑马鱼已广泛用于PDAC基础研究[54]。有研究于2008年构建的PTF1a-eGFP-hKRASG12V单突变斑马鱼在9个月时约70%的鱼群产生了具有侵袭和转移倾向的类似人源的PDAC,组织学呈现腺泡细胞癌、导管腺癌、黏液腺癌的多类型分化[55]。该团队在2011年构建的PTF1a-Gal4-VP16,UAS-eGFP-hKRASG12V双突变斑马鱼在5个月时约50%的鱼群产生了类似人源的PDAC,组织学表现同前[56]。研究表明,将Mia Paca-2细胞注射入幼年和成年斑马鱼体内后均可散在成瘤,该现象可被KRAS抑制剂U0126抑制[57]。亦有学者将荧光标记的PDAC细胞注射入斑马鱼主静脉并动态影像监测细胞转移进程,该模型已用于研究转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)磷酸化在上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及转移中的作用机制[58-59]。

6 结语

生物模型对揭示PDAC发生发展的分子机制及临床前综合治疗效果的评估具有重要意义,但每种模型均有其优缺点,目前尚无能够满足所有研究需求的生物模型。我们需结合研究目的、条件、动物福利等因素选择合适的模型,以期最大程度的降低实验误差,减少资源浪费;同时需改善各模型的弊端,为PDAC基础研究构建最符合人体实际的模型工具。只有这样,才能更精确的认识PDAC,为后续的转化研究提供理论支持。