表皮细胞生长因子及其相关信号通路在角膜损伤修复调控机制的研究进展

焦一典, 牛雨, 马铭绅, 赵海霞

角膜损伤发生阶段具有复杂的病理生理反应, 其中包括了损伤部位临近细胞的移行、激活、增殖、细胞外基质的合成与重构。在角膜损伤修复的过程中, 细胞增殖和定向转移是损伤部位愈合的重要过程。当创伤形成后的早期, 角膜上皮细胞的增殖被控制在创伤边缘, 在细胞出现定向迁移后再增殖。当上皮细胞迁移后将裸露的基质覆盖后, 细胞则迅速进入增殖状态, 并向复层扁平上皮分化。有关角膜损伤治疗方法中, 异体和自体角膜移植术在临床上取得了一定的成功, 但是也存在着供体较少、治疗费用高昂等问题, 这造成角膜损伤病人的治疗存在着一定的局限。随着基因工程的发展, 越来越多生物制品运用在了角膜损伤的治疗工作。目前大量研究已经表明表皮细胞生长因子（epidermal growth factor, EGF）是促进角膜上皮损伤修复的重要因子, 但表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor, EGFR）作用于在不同信号转导通路, 而寻找到相关机制的作用位点或将成为临床中治愈角膜损伤的重要突破方向。

1 EGF的结构与基本功能

伤口愈合是细胞外基质中生长因子、活性氧、细胞、信号通路和细胞因子之间的复杂通讯过程, 其中生长因子是关键调节因子。人类伤口愈合过程中细胞反应的主要调节因子是5种生长因子, 即EGF、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）。EGF由血小板、巨噬细胞和成纤维细胞分泌, 并以旁分泌方式作用于上皮细胞[1］。表皮生长因子家族由多达13个成员组成, 参与上皮创伤修复的主要成员包括EGF、转化生长因子-α（transforming growth factor-α, TGF-α）和肝素结合型表皮生长因子样生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF）。人表皮生长因子（human epidermal growth factor, hEGF）基因存在于4q25-27染色体当中。根据GEO的数据显示其编码的mRNA为4.75 kb, 其蛋白质前体包含有1 217个氨基酸, 分子量为6 kD, 蛋白质分子内部含有二硫键3对, EGF与受体的结合部位在蛋白质20～31位氨基酸残基当中。EGF家族包含蛋白质种类很多, 大部分都与EGF结构相似并能够和EGFR相结合[2-4］。有研究显示在角膜损伤的愈合阶段中, EGF家族各成分能够发挥自身诱导和交叉诱导的作用, 对EGFR持续性激活, EGF与受体结合后会发生磷酸化而产生生物学效应[5］。EGF受体发生磷酸化的模式主要存在两种。其一为EGF和两个受体结合形成二聚体, 造成受体内部磷酸化。另一种形式为受体蛋白产生变构效应, 直接导致受体发生磷酸化, 在受体与配体产生二聚体后, 通过提升受体胞浆的区域内的酪氨酸激酶活性, 引起酪氨酸发生磷酸化并继续发挥相应的生物学效应。

在目前的研究中指出, EGF具有6种生物学功能。①促进胚胎发育, 在小鼠的胚胎中发现牙齿早萌和眼睑早睁与EGF之间存在相关性。②促进胚胎外胚层和内胚层的分化, 参与细胞的分裂与物质代谢过程。在表皮、毛细血管、肉芽组织的形成过程中能够促进伤口的愈合。③激活受体和蛋白激酶C, 增加泪腺分泌蛋白的表达。④对角膜表皮细胞、成纤维细胞发挥促进增殖的作用, 提升基底膜和细胞外基质的合成水平, 加速角膜损伤后的愈合过程。⑤在肝细胞发生损伤后可加速肝细胞的再生过程。在相关研究中表明肝炎发生后, 通过提升hEGF的水平能够转氨酶水平明显下降, 肝脏的重量有所增加, 提升肝细胞的DNA复制能力, 提升肝细胞的生存活力。⑥抑制胃壁细胞分泌胃酸, 对胃溃疡的愈合阶段发挥促进作用, 促进相关神经元的发育。

2 EGF在角膜损伤愈合阶段的作用机制

在目前的研究指出EGF与受体结合后形成的磷酸化是激活下游信号通路, 通过细胞内信号转导对细胞增殖、迁移、分化起到促进作用, 达成修复受损部位的作用。以下是目前与EGF相关的角膜损伤修复机制通路的文献综述。见表1。

表1 与EGF相关的角膜损伤修复机制通路的文献汇总

2.1 EGF与MAPK-ERK通路之间的关系EGF在和酪氨酸激酶受体结合后通过Ras-Raf-丝裂原途径对蛋白激酶激活。丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）信号转导通路对EGF的敏感性较高, 其参与角膜细胞的凋亡与角膜的损伤修复过程, 因此该通路在眼部疾病中常发生激活。在TGF-β1诱导的体外人类Tenon成纤维细胞（human Tenon's fibroblasts, HTFs）当中能够发现, HTFs增殖明显增强, 但是在使用MAPK信号抑制剂和罗格列酮抑制MAPK途径后, HTFs的增殖能力和活化能力均存在不同程度地下降[6］。运用新鲜羊膜和自体治疗的翼状胬肉病人相比, 接受前者治疗病人的泪液中EGF表达更高, 伴随着EGF表达量上调, 病人疮口愈合速度更快[10］。这一研究表明, EGF在角膜损伤过程中能够促进角膜上皮细胞增殖。王泳等[11］分析了自然光暴露50 d对单眼远视离焦幼年恒河猴正常组和准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy, PRK）损伤后组泪液中EGF和TGF-β1的影响, 结果显示PRK组和正常组中的EGF的含量分别（55.93±26.71）ng/L、（40.50±19.91）ng/L, TGF-β1的含量分别为（1 596.51±341.39）ng/L、（716.39±196.63）ng/L, PRK组EGF和TGF-β1含量均高于正常组。研究结果表明自然光对准分子角膜削切术后的个体造成角膜损伤, 同时通过EGF和TGF-β1表达上调, 一方面可以减少角膜的损伤程度, 另一方面可以促进角膜愈合。EGF在促进角膜愈合方面与P38通路之间存在着一定的相关性, TGF-β1是调控P38通路的重要因子, 其激活的方式可能是通过TGF-β1实现的。研究发现, 在大鼠角膜上建立的角膜上皮清创模型中, TGF-β1发挥出加速角膜损伤后愈合的作用, 当将TGF-β1抑制后, 结果造成角膜创伤愈合延迟的现象[12］。目前关于EGF和MAPK-ERK通路之间的直接联系已有研究能够予以证明, 随着通路中相应因子研究的开展, 未来有望在修复角膜损伤方面有临床性的进展。

2.2 EGF与PI3K-Akt-mTOR通路之间的关系磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）具有二聚体结构, PI3K和EGF的关系十分密切。在角膜上皮细胞接收EGF信号之后, 会激活PI3K, 产生磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol triphosphate, PIP3）, 随后启动磷酯酶C-γ（phospholipase C-γ, PLC-γ）通路。研究发现在单层角膜上皮细胞中添加EGF后, PI3K的表达量也随之增加。运用新西兰白兔制造角膜损伤模型后使用EGF眼部给药, 在兔的泪液中能够发现PI3K的表达量增加, 即便是在损伤后48 h的兔角膜已经愈合, 但是在之后的数天之内仍然能够发现泪液中PI3K的表达水平较高[7］。研究结果证实, 角膜损伤后其高表达的PI3K是受到EGF激活所产生的。蛋白激酶B（Akt）是核因子κB（NF-κB）和B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白两种因子的刺激物, NF-κB与多种细胞的凋亡存在相关性[13］。当NF-κB与其抑制蛋白I-κB（inhibitor of NF-κB）在胞质中相结合就可以失去转录活性, 而Akt激活后能够将I κB激酶α（inhibitor kappa B kinase α, IKKα）磷酸化, 造成I-κB磷酸化, 降解与NFκB相结合的I-κB, 使NF-κB游离, 对核内的基因进行诱导, 并促进目的基因表达和细胞增殖。Akt表达时能够介导I-κB的降解和NF-κB的激活, 是调节NF-κB转录水平的重要调节物[14］。Chen等[15］对南极假交替单胞菌的胞外多糖（EPS-Ⅱ）进行了细胞毒性试验, 研究发现白色念珠菌造成的人角膜上皮细胞损伤模型中运用EPS-Ⅱ培养后, 可以有效抑制PI3K-Akt信号转导途径的活化。在翼状胬肉的研究中发现EGF具有表达上调的现象。临床上对翼状胬肉病人切除的角膜组织进行研究, 发现翼状胬肉中pAkt和PI3K的表达均有所提升, 这表明PI3KAkt-mTOR通路参与在角膜损伤的过程[16］。EGF加快角膜损伤的愈合速度, 这与EGF通过激活PI3KAkt-mTOR通路增加了成纤维细胞的增殖抑制其凋亡有一定关系[17］。角膜内皮细胞的增殖受PI3KAkt通路的影响, 阻断PI3K后, 成纤维细胞生长因子2（FGF-2）对成纤维细胞的调节将失去原有功效, 而在未阻断PI3K的角膜内皮细胞中, FGF-2能够诱导内皮细胞增加Ⅰ型胶原蛋白的合成。因此能够看出激活PI3K-Akt通路是诱导角膜内皮细胞分化的重要途径。

2.3 EGF与FAK-ERK通路之间的关系胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）是调控角膜损伤中上皮细胞细胞周期的重要蛋白。将神经生长因子添加在人角膜上皮细胞的体系中, 能够明显发现神经生长因子能促进人角膜上皮细胞中的D型细胞停留在了G1期, 同时周期蛋白的合成水平也有所改变, 在随后的研究中发现随着生长因子浓度的提升人角膜上皮细胞的MAPK、ERK蛋白生成量有所增加。Hu等[18］通过研究ERK对新生大鼠培养的肺成纤维细胞（lung fibroblasts, LFS）的影响, 设立对照组、EGF组、ERK抑制剂PD98059组和EGF+PD98059组, 采用免疫细胞化学和蛋白质印迹法检测各组p-ERK1/2表达量, 结果显示EGF组LFS中p-ERK1/2水平明显高于对照组（P＜0.01）, 被EGF激活的p-ERK1/2通过加速细胞周期从G1期到S期的进程来促进LFS增殖。Rmilah等[19］发现在使用人骨髓间质干细胞所得到的培养基MCS-CM能够将p27降解, 同时将PI3K、ERK1/2激活刺激人角膜内皮细胞增殖, 保持角膜内皮细胞的所有功能并完成分化。

黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）是受到酪氨酸激酶活性影响的一种特殊蛋白, 具有诱导细胞增殖、减少细胞凋亡的重要功能, 其主要的作用方式是与ERK蛋白形成联动, 也是角膜上皮细胞运动与恢复迁移能力的重要调控因子。在利用低剂量过氧化氢制造的模型中能够发现, FAK-Src的活性增强, 同时其对角膜上皮细胞的迁移能力有所提升, 加速损伤部位的修复[20］。而在单纯疱疹性角膜炎的模型中通过肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）激活人角膜上皮细胞的FAK-ERK途径更为明显, 同时发现MMP-2、MMP-9这两种与炎症相关的因子表达水平也逐渐增强[21］。Jeong等[8］在A549细胞培养体系中分别加入EGF和不同剂量的EGF抑制剂（蜂毒素）。蛋白质印迹法检测结果表明, 加EGF组的A549细胞ERK、JNK、FAK和mTOR的表达量均增高（P＜0.05）, 而加入抑制剂组A549细胞ERK、FAK、mTOR的表达量降低（P＜0.05）, 且与加入抑制剂的剂量有关。因此我们可以推断出EGF在角膜损伤修复的过程中通过提升FAK-ERK通路活性, 达成对角膜生长周期调控激活的目的, 而使病人的角膜愈合速度提升。

2.4 EGF与YAP-Hippo通路之间的关系Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）是一种通过与具有PDZ结合序列的转录共激活子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif, TAZ）结合而发挥激活基因转录的蛋白质, Hippo通过与TEAD1-4结合后而发挥促进转录的作用, 对通路活性起到调节的重要调节因子。Hippo的激活能造成YAP和TAZ两种蛋白质的磷酸化, 而这两种蛋白的磷酸化则造成YAP和TAZ在细胞中由细胞核转移至细胞质基质中, 从而YAP和TAZ对细胞转录的调控起到抑制作用[22-24］。YAP是Hippo激酶联级作用的效应分子, 能够起到增强TEAD的作用, 在上游激酶未激活的条件下, YAP由细胞质基质转移进入细胞核中。由于蛋白质的结构中不含有DNA结合功能的结构域, 造成YAP不能与DNA相结合, YAP在DNA结合转录因子的辅助下, 发挥调节靶基因的生物学功能的作用[25］。在基因组学的研究背景下发现YAP和TAZ通过力学感受器的作用能够发挥出核心的作用。研究发现, 角膜组织中蛋白磷酸化是YAP和TAZ活性调节的主要途径, 非磷酸化的YAO和TAZ在细胞核中与TEAD、RUNX、SMAD相结合, 而磷酸化后YAP、TAZ则在细胞质机制中被泛素化降解[26］。有研究显示与溶血磷脂相关的自分泌蛋白（aototaxin, ATX）在青光眼的活动阶段存在明显上调的现象, 而降低溶血磷脂后能够有效降低眼压[27］。溶血磷脂是YAP/TAZ的激活剂, 也有观点认为在青光眼发病的过程存在ATX-LPA-YAP/TAZ的新型信号转导途径[28］。在Kabza等[9］的研究中, 对圆锥角膜病人的角膜细胞和未患圆锥角膜对照组的角膜细胞进行RNA-seq检测发现, 圆锥角膜病人角膜细胞Hippo、Wnt、EGF的转录水平均存在不同程度地下调, 这可以初步判断出EGF与Hippo之间存在着一定的相关性。有学者在卵母细胞和卵丘卵母细胞复合体培养基中添加pSMAD2/3抑制剂, 发现YAP1被抑制后, 卵母细胞和卵丘卵母细胞的增殖受到影响, 研究表明YAP1在排卵期能够抑制Hippo的转录活性[29］。应用10 μg/L EGF处理卵母细胞和卵丘卵母细胞复合体后, 发现EGF能够造成YAP1磷酸化水平显著提升, 降低YAP1蛋白的水平。虽然在卵母细胞中的研究只发现EGF和YAP-Hippo通路之间存在相关性, 但是并不能排除EGF在角膜中对YAPHippo通路的调节功能。即使现在相关研究的开展并没有能够提供确切的结论, 在各个方面的研究还是能够提供一定的参考价值。

2.5 EGF与Wnt通路之间的关系Wnt信号转导途径存在于多细胞生物的发育当中, 该通路广泛参与到细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭等各个阶段, 在多个器官的病理生理学诊断中发挥着重要的作用。Wnt是一种含有多种配体的蛋白, 其典型特征为蛋白体内含有22～24个半胱氨酸残基, 在细胞膜上存在FZD家族蛋白与Wnt蛋白相结合。体内多种物质都是该通路的激活剂, 如低密度脂蛋白相关蛋白LRP5/6、酪氨酸激酶样孤儿受体ROR2/RYK等[30-33］。大量研究均表明Wnt通路在角膜的发育过程具有重要的作用, 在一项对小鼠敲除LRP5、LRP6基因的研究中观察发现小鼠的角膜发育存在障碍[34-35］。有学者通过研究鸡胚原位杂交, 观察鸡胚胎的发育, 发现胚胎眼部表皮外胚层和角膜上皮均有Wnt2b、Wnt6、Wnt9b等基因的表达[36］。Wnt 通路也广泛参与角膜损伤后的创伤愈合阶段, 通过在角膜损伤组织采样, 发现角膜损伤区域的Wnt7a表达水平升高。随着Wnt 通路表达提升, 周边部位β-连环蛋白（β-catenin）和Rac的活性和基质中MMP-12的转录水平提高, 且角膜周边部位细胞增殖水平也有所提升[37-39］。Xie等[40］采用免疫组织化学方法研究Wnt7a的表达与口腔鳞癌进展的关系。结果表明EGF刺激癌细胞后能够增加口腔鳞状细胞癌的Wnt7a表达量, 并增加细胞的增殖能力和迁移能力。尽管在角膜损伤阶段没有相关研究能够表明, EGF与Wnt 通路之间的关系, 但是已有的研究在确定Wnt通路参与角膜损伤修复阶段后, EGF在这一通路发挥的作用显而易见, 相关研究的开展也有待进行。

3 总结与展望

综上所述, 在角膜损伤发生后EGF的加入能够加速创伤部位的愈合速度。依据现有的研究, 可以发现EGF加速损伤部位的愈合大致与PI3K-AkmTOR通路、FAK-ERK通路、MAPK-ERK、YAP-Hippo、Wnt通路存在相关性, 同时大量的实验均能为其提供理论依据。因此我们认为在EGF相关药物的开发中如改变MAPK-ERK、Akt-mTOR、FAK-ERK、YAP-Hippo、Wnt这5个通路上游靶点的调控因子, 或许将能够提升EGF的治疗效果, 并能降低屈光术后病人的致盲风险。