谷氨酰胺酶抑制剂CB-839介导T细胞效应抑制肺癌细胞中αKGA、Gln转化的作用机制*

张启新，周 游，黄 飞△

南通市海门区人民医院:1.胸外科;2.病理科，江苏南通 226100

肺癌是由于下呼吸道产生病变或腺体组织发生异常所引起的一种重大疾病，其可分为两种病型：中央型，产生于支气管与叶支气管中，常见会引发鳞癌等；周围型，产生在下支气管和肺泡中，常见会引发腺癌[1]。导致肺癌产生的原因复杂多样，长期吸烟、环境影响、不健康饮食习惯及患有严重的肺部疾病等均可引起肺癌的发生。肺癌患者病情的严重程度与肿瘤发生的部位及大小等联系甚密。肺癌早期存在隐匿性，一般无明显临床特征，中晚期主要临床症状为咳嗽、咯血等。神经系统及骨组织是肺癌细胞最常见的转移部位，且其转移的部位与其临床产生的病症联系密切，此外，肺癌还可转移至肝脏、胃肠道等[2]。谷氨酰胺酶抑制剂CB-839(简称CB-839)是一种针对癌细胞对谷氨酰胺(Gln)代谢依赖所研究的靶向药物，且已有研究证实，CB-839对宫颈癌、黑色素瘤均有显著的抗肿瘤作用[3-4]。调节性T细胞在免疫调节中具有重要作用，参与肿瘤的产生及转移。在结肠癌、肝癌等多种肿瘤中均发现高比率的T细胞，在肺癌中发现其与癌细胞的侵袭呈正相关[5-7]。上述研究提示，T细胞在肿瘤组织中大量聚集导致癌细胞通过免疫逃逸形成肿瘤。Gln参与细胞生长。报道显示，在肺癌中Gln可影响癌细胞的增殖，抑制其水平后可促进癌细胞凋亡[8]。α-酮戊二酸(αKGA)作为Gln的前体物质，是三羧酸循环的代谢产物，与氨结合生成谷氨酸和Gln。αKGA能有效促进机体氮代谢，可以降低铵离子对机体的毒性[9]。目前，关于CB-839对肿瘤T细胞效应及Gln转化机制尚不明确，因此，本文研究CB-839介导T细胞效应抑制肺癌细胞αKGA向Gln转化的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验细胞及动物来源 人肺癌细胞A549购自上海匹拓公司，10只SPF级健康SD裸鼠购自北京亿鸣复兴公司，许可证号：SCXK(京)2020-0311，体重20～25 g，鼠龄2～4周，适应性饲养1周后进行实验，饲养环境许可证号:0011277。本次实验已经过本院动物伦理委员会审批(批号：20200227)。

1.2实验试剂 CB-839(上海阿拉丁公司)、MTT溶液(南京森贝伽公司)、青霉素(山东康迪公司)、流式细胞仪(邢台瑞联公司)、酶标仪(山东恒美公司)、αKGA试剂盒(泉州睿信公司)、链霉素(武汉罗森杰公司)。

1.3实验分组与肺癌细胞A549与CB-839共培养 A549细胞于常规培养箱中培养，待细胞生长至85%左右时传代。当细胞传至第3代时，收集细胞(5×104个/mL)并接种到96孔板中，常规培养。次日，细胞贴壁后，将细胞分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组。CB-839浓度参照文献[10]进行，Ⅰ组常规培养，Ⅱ组给予0.25 μmol/L浓度CB-839、Ⅲ组给予0.50 μmol/L浓度CB-839、Ⅳ组给予1.00 μmol/L浓度CB-839。显微镜下观察细胞形态，见图1。

注：A(Ⅰ组肺癌A549细胞)细胞贴壁生长，呈梭形或多角形,部分细胞有突起，可见处于不同分裂相的细胞，增殖能力较强，细胞散在分布，体积较大，轮廓较清晰，边缘光滑，细胞质丰富透亮；B(Ⅱ组肺癌A549细胞)、C(Ⅲ组肺癌A549细胞)和D(Ⅳ组肺癌A549细胞)细胞可见细胞形态发生明显改变，许多细胞形态回缩变圆、与周围细胞脱离，甚至脱离瓶底，漂浮于培养液中细胞的边缘僵硬，细胞核轮廓欠清，细胞质浑浊，透光性欠佳。

1.4肺癌动物模型建立 将肺癌细胞离心制成细胞悬液(5×106)后，接种于裸鼠右腋皮下，每只裸鼠注射0.2 mL。待移植瘤生长至肉眼可见后，将成瘤小鼠随机分为模型组、抑制剂组，每组5只。模型组裸鼠常规饲养；抑制剂组裸鼠皮下注射CD-839 20 mg/kg，1次/天，共2周，治疗过程中模型组及抑制剂组均无死亡。

1.5检测指标

1.5.1MTT法检测肺癌A549细胞增殖情况 取各组细胞接种于96孔板中，设置6、24、48、72 h时间点，加入MTT溶液，孵育4 h后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，震荡10 min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪检测450～490 nm波长处各孔的吸光度(A值)，参比波长为600～650 nm。以A值来反映其增殖情况。

1.5.2流式细胞仪检测肺癌A549细胞凋亡 于96孔板中接种各组肺癌A549细胞常规培养，24 h后弃培养液，采用乙二胺四乙酸的胰酶消化细胞，离心5 min，2 000 r/min，弃去上清液，PBS清洗，加入500 μL结合缓冲液，10 μL PI及5 μL AnnexinV-FITC，混匀，无光孵育5 min，流式细胞仪测细胞凋亡，细胞凋亡率(%)=凋亡细胞计数所有细胞计数×100%。

1.5.3流式细胞术检测T细胞CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)水平 于96孔板中接种各组肺癌A549细胞，24 h收集细胞，PBS清洗，加入10%山羊血清4 ℃无光孵育25 min，PBS清洗，1∶100比例加入PE anti-mouseCD80、FITCanti-mouseCD86、PerCP/Cy5.5anti-mouseI-A/I-E抗体，4 ℃无光孵育15 min后，加入1 mL流式缓冲液，充分洗涤。500 μL流式缓冲液重悬后，流式细胞仪检测，复孔2次，实验重复3次。

1.5.4RT-qPCR检测谷氨酸脱氢酶(GLUD1)、谷氨酰胺酶(GLS)mRNA水平 取各组肺癌A549细胞，25%胰蛋白酶消化后重悬细胞，将细胞悬液防御试管中。Trizol提取总RNA,逆转录cDNA后进行实验，条件为42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃终点。每个细胞设置6个复孔，内参为β-actin，反应条件为95 ℃预作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，40个循环，计算方法用2-ΔΔCt法进行分析，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.5αKGA测定试剂盒检测αKGA水平 严格按照试剂盒说明进行操作，取各组肺癌A549细胞，离心20 min后收集上清液，4 ℃密封保存。设置标准孔和样品孔，在样品孔中加入50 μL αKGA，除空白孔外，标准样品孔和样品孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的检测抗体，封闭1 h，祛除封闭液，清洗，无光孵育15 min，加入50 μL终止液，450 nm测定A值。

1.5.6检测各组裸鼠瘤重 治疗结束后，处死各组裸鼠，取出瘤体，采用游标卡尺测量瘤体的长径(L)和短径(W)，计算肿瘤体积(V=L×W2/2)。

2 结 果

2.1各组肺癌A549细胞增殖情况比较 培养6 h时各组肺癌A549细胞A值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；培养24、48 及72 h时Ⅰ组肺癌A549细胞A值高于Ⅱ组，差异有统计学意义(P<0.05)；培养24、48 及72 h时Ⅱ组肺癌A549细胞A值高于Ⅲ组，差异有统计学意义(P<0.05)；培养24、48 及72 h时Ⅳ组肺癌A549细胞A值与Ⅲ组比较，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组肺癌A549细胞增殖情况比较

2.2肺癌A549细胞凋亡检测结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ组肺癌A549细胞凋亡率分别为(3.02±0.39)%、(4.72±0.52)%、(7.95±0.84)%及(13.22±1.28)%。Ⅰ组肺癌A549细胞凋亡率较Ⅱ组明显降低(t=7.860，P<0.05)，Ⅱ组细胞凋亡率低于Ⅲ组(t=9.240，P<0.05)，与Ⅲ组相比，Ⅳ组肺癌A549细胞凋亡率升高明显(t=8.290，P<0.05)。

2.3各组肺癌A549细胞中T细胞CD80、CD86、MHCⅡ水平检测结果 Ⅰ组肺癌A549细胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平低于Ⅱ组；Ⅱ组肺癌A549细胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平低于Ⅲ组；与Ⅲ组相比，Ⅳ组肺癌A549细胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组肺癌A549细胞CD80、CD86、MHCⅡ水平对比

图2 各组CD80、CD86、MHCⅡ水平对比

2.4各组肺癌A549细胞GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平检测结果 Ⅰ组肺癌A549细胞中GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平高于Ⅱ组(tGLUD1 mRNA=2.408，PGLUD1 mRNA=0.036；tGLS mRNA=2.930，PGLS mRNA=0.015)，Ⅱ组GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平高于Ⅲ组(tGLUD1 mRNA=2.341，PGLUD1 mRNA=0.041；tGLS mRNA=2.578，PGLS mRNA=0.027)，Ⅲ组GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平高于Ⅳ组(tGLUD1 mRNA=3.217，PGLUD1 mRNA=0.009；tGLS mRNA=2.408，PGLS mRNA=0.036)，见表4。

表4 各组肺癌A549细胞GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平对比

2.5各组肺癌A549细胞中αKGA水平检测结果 Ⅰ组肺癌A549细胞中αKGA水平(2.43±0.24)高于Ⅱ组(1.62±0.12)；Ⅱ组肺癌A549细胞中αKGA水平高于Ⅲ组(1.31±0.11)； Ⅳ组肺癌A549细胞中αKGA水平(1.03±0.09)与Ⅲ组比较，明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.6GLUD1 mRNA、GLS mRNA、αKGA相关性分析 GLUD1 mRNA与GLS mRNA呈正相关(r=0.671，P<0.001)，GLUD1 mRNA与αKGA呈正相关(r=0.708，P<0.001)。GLS mRNA与αKGA呈正相关(r=0.671，P<0.001)。见图3。

图3 GLUD1 mRNA、GLS mRNA、αKGA相关性分析

2.7瘤体体积及质量检测结果 模型组裸鼠瘤体体积(208.33±14.28)mm3，瘤体质量(1.42±0.66)g，均高于抑制剂组裸鼠瘤体体积(110.24±9.37)mm3，瘤体质量(0.84±0.42)g，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 各组裸鼠瘤体体积对比

3 讨 论

据有关报道统计，在全球范围内，肺癌的发病概率及死亡人数逐年增长，且其预后较差，因此，对于肺癌的治疗至关重要[11]。

靶向恶性肿瘤新陈代谢的治疗是近年热门的研究领域。Gln的代谢可促进肿瘤发展，因此，抑制其水平发展成为了治疗肿瘤的新方向。在本研究中提出，随着CB-839浓度的增加，肺癌细胞的增殖逐渐降低，凋亡逐渐增加，呈现出剂量依赖性，且大鼠实验结果显示CB-839可抑制肺癌裸鼠移植瘤瘤体体积。廖英等[12]在研究谷氨酰胺酶抑制剂的实验中提出，其可抑制肿瘤细胞的增殖。沈伟涛等[13]对肺癌细胞的实验中提出，CB-839通过抑制肺癌细胞增殖、促进凋亡，改善病情发展。本研究与文献[12-13]报道结果相似。未成熟树突状细胞常呈现低表达的MHCⅡ，导致T细胞无反应，促进肿瘤的发展。诱导树突状细胞适当活化和调控适应性免疫反应可以清除有害的病原体或肿瘤细胞。在肿瘤微环境中，由于受肿瘤免疫抑制影响，树突状细胞无法通过表达抗原肽复合物和共刺激分子，向毒性T淋巴细胞提供抗原活化信号，甚至进一步促进Treg的增殖，抑制T细胞杀伤效应，CD80、CD86、MHCⅡ标志着树突状细胞的成熟[14]。CB-839可通过诱导肿瘤氧化反应及能量应激提高免疫功能，发挥抗肿瘤作用。本研究发现，经过CB-839干预后肺癌细胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平升高，且呈现出明显的剂量依赖性。在张雪伟等[15]对肺癌细胞的实验研究中提出，红景天苷通过提高CD80、CD86、MHCⅡ水平，加快树突状细胞的成熟，清除癌细胞，改善病情发展。马国峰[16]在对肾癌的实验中提出，Gln剥夺后通过调控T细胞改善免疫功能，抑制肿瘤生长。本研究与上述研究结果相似，因此本研究认为，CB-839通过调控T细胞，杀伤肺癌细胞，阻滞肿瘤发展。

综上所述，CB-839可能通过介导T淋巴效应提高CD80、CD86、MHCⅡ水平，抑制αKGA及Gln相关基因转化，从而降低肺癌细胞活性，促进其凋亡，为今后肺癌的临床治疗及新药研发提供参考依据。