鸡毒支原体和滑液囊支原体四重PCR 检测方法的建立

刘洋洋，白红英，胡思顺，毕丁仁，李自力，周祖涛

（1.广东茂名农林科技职业学院动物科学系 广东茂名 525000；2.华中农业大学动物医学院/农业部兽用诊断制剂创制重点实验室 武汉 430070）

鸡毒支原体（mycoplasma gallisepticum，MG）主要引起鸡的慢性呼吸道疾病，导致感染鸡群出现咳嗽、啰音等症状，造成肉鸡胴体品质下降，种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等，发病后非常容易引起与大肠杆菌的继发感染，从而使死亡率上升，给养殖业造成较大的经济损失[1]。在我国禽类养殖场中MG 的感染率很高。滑液囊支原体病是禽的一种急性或慢性传染病，主要感染鸡和火鸡，鸭、鹅、珍珠鸡等也具有易感性[2]。主要导致关节肿大、跛行、采食量下降、咳嗽、打喷嚏及胴体品质下降等[3]，给全世界的养禽企业造成了巨大的经济损失。

王传禹等[4]对云南省72 个规模化养禽场474 份病例进行检测，结果显示家禽细菌病占比62.87%，其中支原体发病比例为10.76%。姜兰兰等[5]对北京地区127 个养鸡场、3,910 份血清进行ELISA 抗体检测，结果显示MG 和MS 的平均场群阳性率为89.0%和86.6%。MG 和MS 既可水平传播，也可经种蛋垂直传播[6,7]，给该病的防控及净化带来了极大的困难。

目前，防治MG 的最有效办法就是应用弱毒疫苗株F 株或油乳佐剂疫苗进行预防接种，但弱毒疫苗株F 株疫苗会终生存在于免疫鸡群的上呼吸道，干扰临床样品检测[8]。另外，MG 弱毒疫苗并不能百分之百阻止MG 在鸡群中的水平传播。因此，部分鸡群会出现免疫后感染的情况，这时，感染鸡群体内同时存在MG 弱毒疫苗株F 株和非F 株，会影响检测结果的准确性，进而影响MG 的控制和净化。另外，MG 与MS 经常发生混合感染[9]，由于MS 也可引发气囊炎等呼吸道症状，所以在临床症状上较难与MG 感染进行区分。因此，建立一种能够特异、快速区分MG 弱毒疫苗株F 株与非F 株以及MG 和MS 的检测方法是非常必要的。本研究优选合适的基因建立了能够通过一次PCR 反应区分MG 弱毒疫苗株F 株与非F 株以及MG 和MS 的四重PCR 检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

2×Taq PCR Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司，DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程有限公司。琼脂糖购自西班牙Biowest 公司，Goldview I 型核酸染色剂购自北京索莱宝有限公司，10×loading buffer 购自大连宝生物工程有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 毒株

MG 弱毒疫苗株F 株以及S6 株均由华中农业大学微生物与免疫学实验室保存，MG HS 株由华中农业大学微生物与免疫学实验室分离保存，滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）ATCC25204由甘肃农业大学包世俊老师馈赠，链球菌SC19（由华中农业大学张安定老师课题组馈赠），沙门氏菌（CVCC542）、大肠杆菌（ATCC25922）均由华中农业大学栗绍文老师课题组馈赠。

1.3 引物的设计与合成

通过NCBI 中的GenBank 网站，选择鸡毒支原体F 株MGF_3486 基因序列（登入号：CP001873.1）、鸡毒支原体Rlow 株MGA_0798 基因（登入号：AE015450.2）、鸡毒支原体Rlow 株MGA_0319 基因（登入号：AE015450.2）以及登入号为JF449893 的MS 热休克蛋白酶基因为靶标基因，将靶标基因进行BLAT 比对分析，分别选取靶基因序列的保守区设计了4 对多重PCR 引物，MG弱毒疫苗株F 株引物、MG 非F 株引物、MG 通用引物以及MS 引物分别以MGF、MGq、MGT、MS 表示，引物序列见表1。

表1 四重PCR引物序列信息

1.4 基因组的提取

根据细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书分别提取MG 弱毒疫苗株F 株、MG 强毒株S6 株以及HS 株，滑液囊支原体（MS）、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的基因组DNA 作为模板，置-20℃备用。

1.5 四重PCR 引物特异性试验

以MG 弱毒疫苗株F 株、MG 强毒株S6 株以及HS 株，滑液囊支原体（MS）、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的基因组DNA 作为模板，使用常规单重PCR 验证MG 弱毒疫苗株F 株引物、MG 非F 株引物、MG 通用引物以及MS 引物的特异性或通用性。

1.6 四重PCR 反应条件的优化

使用常规PCR 方法确定每一种引物的反应条件，反应体系为2×Taq PCR Master Mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL，无菌蒸馏水补充至20μL。在单重PCR 的基础上，合理调整引物的浓度以及退火温度等，逐级建立四重PCR 反应，确定四重PCR 的最佳反应条件。

1.7 四重PCR 反应的敏感性试验

将MG 弱毒疫苗株F 株、MG-S6 株、MS 株的基因组浓度稀释至10ng/μL，各取10μL 充分混合均匀，然后再将其依次进行10 倍倍比稀释，设置101、102、103、104、105、106、107倍七个稀释梯度，进行四重PCR 反应，检测鸡毒支原体、滑液囊支原体四重PCR 反应灵敏性。

2 结果

2.1 四重PCR 引物特异性试验

1）MG 弱毒疫苗株F 株引物特异性试验 利用1.6 中反应体系对MG 弱毒疫苗株F 株引物进行特异性检测，仅有MG 弱毒疫苗株F 株能够扩增出特异性条带，条带大小为750bp，符合结果预期。而MG-S6 株、MG-HS 株、MS、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均未扩增出特异性条带，见图1。

图1 MG 弱毒疫苗株F 株引物特异性试验

2）MG 非F 株引物特异性试验 利用1.6 中反应体系对MG 非F 株引物进行特异性检测，其中MG-S6 株、MG-HS 株能够扩增出特异性条带，条带大小为585bp，符合结果预期。而MG 弱毒疫苗株F 株、MS、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均未扩增出特异性条带，见图2。

图2 MG 非F 株引物特异性试验

3）MG 通用引物特异性试验 利用1.6 中反应体系对MG 通用引物进行特异性检测，其中MG 弱毒疫苗株F 株、MG-S6 株、MGHS 株能够扩增出特异性条带，条带大小为279bp，符合结果预期。而MS、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均未扩增出特异性条带，见图3。

图3 MG 通用引物特异性试验

4）MS 引物特异性试验 利用1.6 中反应体系对MS 引物进行特异性检测，其中MS 能够扩增出特异性条带，条带大小为421bp，符合结果预期。而MG 弱毒疫苗株F 株、MG-S6 株、MG-HS 株、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均未扩增出特异性条带，见图4。

图4 MS 通用引物特异性试验

2.2 四重PCR 反应体系的建立

利用单重PCR 反应体系中引物、模板比例以及反应条件经多次摸索、反复验证逐步建立二重PCR、三重PCR，最终建立MG、MS四重PCR 检测方法，具体反应体系见表2。

表2 四重PCR反应体系

最佳反应条件：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火51.5℃30s，延伸72℃1min，进行30 个循环；最后延伸72℃10min，4℃保存。

2.3 四重PCR 灵敏性检验

按照1.7 中各基因组处理方法制备PCR 反应模板，按照四重PCR 反应体系建立PCR 反应进行四重PCR 灵敏性检验，随着模板浓度的降低，扩增条带亮度逐渐降低，结果显示：四重PCR 反应的最低检出量均为100fg/μL，见图5，表明本试验建立的检测方法灵敏度良好。

图5 四重PCR 灵敏性试验

3 讨论

MG 主要引起鸡的呼吸道症状，导致鸡胴体合格率、受精率、产蛋率等下降，给养禽业造成了严重的经济损失。目前鸡毒支原体的预防主要依靠疫苗免疫，而MG 弱毒疫苗株F 株的广泛使用，使得弱毒疫苗株与非F 株的鉴别诊断成为了养殖业的难题，尤其是出现家禽疫苗免疫后再被野毒感染的情况，严重影响了养殖场的净化检测。MS 感染可引起家禽呼吸道症状、关节炎和气囊炎等症状[10]，所以MS 感染和MG 感染症状相似，因此在临床上难以区分。所以，建立一种可以区分MG 弱毒疫苗株F 株与非F 株以及MS 的检测方法对于MG 和MS 的防控具有重要意义。

分子生物学方法在MG 和MS 的检测中应用广泛，尤以PCR方法应用最为广泛，本研究根据GenBank 中MG 和MS 的相应序列，应用NCBI 中的Blast 功能进行基因序列分析，选取合适的基因片段设计合成了四套PCR 引物，通过对7 种抗原的检测，验证了引物的特异性。本研究与杨美等[11]、钱琳娜等[12]、杨斌等[13]建立的可以区分MG 和MS 的PCR 检测方法相比，具有在一次PCR 反应基础上区分MG 和MS 的同时又可以区分MG 弱毒疫苗株F 株与非F株的优势，为MG 和MS 的防控提供指导意见。

4 结论

本研究建立了鸡毒支原体和滑液囊支原体的四重PCR 检测方法，可以区分鸡毒支原体弱毒疫苗株F 株和非F 株与滑液囊支原体。该方法灵敏度高，最低基因组检测限度为100fg/μL，能够为MG和MS 的净化提供检测技术支持。