一测多评法同时测定沙芪浓缩丸中5 种黄酮

2023-03-16 10:14萨出拉王秀枝杨立国包书茵奥乌力吉
中成药 2023年2期
关键词:异鼠李素毛蕊

萨出拉,王秀枝,杨立国包书茵*,奥乌力吉*

(1.内蒙古民族大学,内蒙古 通辽 028000; 2.内蒙古自治区蒙医药研究所,内蒙古 呼和浩特 010020;3.通辽职业学院,内蒙古 通辽 028000)

蒙药沙芪浓缩丸中君药沙蓬是藜科植物沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.的干燥地上部分,为蒙古族习用药材,蒙文名楚力格日,具有祛疫、清热、解毒、利尿等功能[1-2],用于治疗“疫热增盛,身目黄疸,尿道灼痛,肾热”[3-4]。沙蓬种子是药食同源物,迄今已中分离得到黄酮、三萜皂苷、生物碱、酚苷等化合物[5-7],研究表明,其皮中的黄酮类成分芦丁、异槲皮苷、异荭草素具有较强的清除自由基DPPH 的能力[8];乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有显著降血糖活性,并且水提物、醇提物可显著降低糖尿病大鼠血糖、血脂,改善糖耐量[9-11],另外该药材对糖尿病肝损伤也有良好的抑制作用[12-13]。目前,正逐步研发沙蓬与不同药物配伍而具有抗氧化、抗炎、改善肝肾功能功效的新药[14],但尚无沙芪浓缩丸中多成分含量同时测定的报道。

王智民等[15]首次提议,采用一测多评法对中药进行多指标质量控制,它是采用1 种易得对照品作为内标,从而实现对多成分含量同时测定的手段[16-18]。本实验采用该方法同时测定沙芪浓缩丸中毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素5 种黄酮的含量,以期为该制剂质量评价提供有效参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies 公司);Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters 公司);ZDHW 调温电热套(河北中兴伟业实验仪器有限公司);CCA-112 冷却水循环装置(上海爱朗仪器有限公司);HH-2 数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);TDI0001A、YP10001 电子天平(上海佑科仪器表有限公司);KQ-C20 玻璃仪器气流干燥器、R-1010 旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司);UPH-I-20L 优普系列超纯水器(四川优普超纯科技有限公司);LDZ4-0.8 离心机(北京医用离心机);DHG-9145A 鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);T-1200N 马弗炉(郑州天纵电器设备有限公司);锥形瓶;蒸发皿;硅胶G 薄层板;称量瓶;量瓶;无灰滤纸;坩埚。

1.2 试剂与药物 沙芪浓缩丸(自制,批号202009、202105、202106)。毛蕊异黄酮苷(纯度>98%,CAS 号20633-67-4,批号B20847)、水仙苷(纯度>98%,CAS 号604-80-8,批号B2179)、异鼠李素(纯度>98%,CAS 号78-70-6,批号B21554)、银锻苷(纯度>98%,CAS 号20316-62-5,批号B21578)、芒柄花素(纯度>98%,CAS 号485-72-3,批号B20836)对照品均购于上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Welch LP-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-0.4% 磷酸(B),梯度洗脱(0~10 min,15%A;10~15 min,15%~38% A;15~25 min,38%~42% A;25~30 min,42%~82%A);体积流量1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长260 nm;进样量10 μL,色谱图见图1。由此可知,各黄酮色谱峰分离度均大于1.5。

图1 各黄酮HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various flavonoids

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素对照品1.25、1.47、1.23、1.96、2.47 mg,25 mL 70%甲醇摇匀溶解,分别制成每1 mL 分别含各成分0.025、0.029、0.024、0.039 2、0.049 mg 的 溶液,即得。

2.3 供试品溶液制备 取本品粉末(过4 号筛)约1 g,加50 mL 90% 甲醇(含1% 甲酸),超声(功率100 W,频率40 kHz)处理60 min,滤过,取25 mL 滤液,在40~50 ℃下蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至5 mL 量瓶中并定容至刻度,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜过滤,即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液适量,稀释成不同质量浓度(水仙苷0.029 4、0.058 8、0.117 6、0.176 4、0.235 2、0.294 mg/mL,银锻苷0.024 6、0.049 2、0.098 4、0.147 6、0.196 8、0.246 mg/mL,毛蕊异黄酮苷0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL,异鼠李 素0.039 2、0.078 4、0.156 8、0.235 2、0.313 6、0.392 mg/mL,芒柄花素0.049 4、0.098 8、0.197 6、0.296 4、0.395 2、0.494 mg/mL),在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各黄酮线性关系Tab.1 Linear relationships of various flavonoids

2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素峰面积 RSD 分别为 0.13%、0.17%、0.02%、0.07%、0.07%,表明仪器精密度较好。

2.4.3 稳定性试验 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,室温下于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素峰面积RSD 分别为 0.86%、0.77%、0.89%、1.90%、1.10%,表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 精密称取同一批本品粉末(批号202009)0.5 g,按“2.3” 项下方法制备6份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素峰面积RSD 分别为1.57%、1.93%、1.24%、1.13%、1.92%,表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取同一批本品粉末(批号202009)6 份,每份0.5 g,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密量取含毛蕊异黄酮苷1.0 mg、水仙苷1.2 mg、银锻苷0.3 mg、异鼠李素0.4 mg、芒柄花素0.3 mg 的对照品溶液1 mL,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素平均加样回收率分别为95.80%、98.08%、91.90%、94.66%、99.82%,RSD 分别为0.45%、0.42%、0.26%、0.64%、0.60%。

2.5 相对校正因子考察

2.5.1 计算方法 取“2.2” 项下对照品溶液适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,以毛蕊异黄酮苷为内标,计算其他4 种黄酮的相对校正因子fk/s,公式为fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk),其中Ck为其他成分含量,Ak为其他成分峰面积,Cs为内标含量,As为内标峰面积,结果见表2。

表2 各黄酮相对校正因子Tab.2 Relative correction factors for various flavonoids

2.5.2 耐用性试验 本实验分别考察了Waters e2695、Agilent 1260 色谱仪及 Welch LP-C18、Agilent ZORRA plus-C18、Venusil XBP-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)对相对校正因子的影响,结果见表3,可知均无明显影响(RSD <2.0%)。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.3 不同体积流量对相对校正因子的影响 本实验考察了体积流量0.3、0.5、0.8、1 mL/min 对相对校正因子的影响,结果见表4,可知均无明显影响(RSD<2.0%)。

表4 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.5.4 不同柱温对相对校正因子的影响 本实验考察了柱温25、30、35、40、45 ℃对相对校正因子的影响,结果见表5,可知均无明显影响(RSD<2.0%)。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.5.5 不同质量浓度对照品溶液对相对校正因子的影响 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液适量,依次稀释至0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08 mg/mL,考察它们对相对校正因子的影响,结果见表6,可知均无明显影响(RSD<2.0%)。

表6 不同质量浓度对照品溶液对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different concentrations of reference solutions on relative correction factors

2.5.6 检测波长对相对校正因子的影响 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液4 份,分别在252、254、256、260 nm 波长处检测,考察它们对相对校正因子的影响,结果见表7,可知均无明显影响(RSD<2.0%)。

表7 不同检测波长对相对校正因子的影响Tab.7 Effects of different detection wavelengths on relative correction factors

2.5.7 样品含量测定 取3 批样品,每批3 份,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,分别采用外标法、一测多评法计算含量,结果见表8。由此可知,2 种方法所得结果接近[相对平均偏差(RAD)<2%],表明一测多评法可用于本实验含量测定。

表8 各黄酮含量测定结果(mg/g, n=3)Tab.8 Results of content determination of various flavonoids(mg/g, n=3)

3 讨论

沙芪浓缩丸以沙蓬为君药,黄芪为臣药,两者均含黄酮类成分[19-20],具有抗炎、抗氧化、抑制糖尿病等作用[21-22]。首先,本实验考察不同供试品溶液制备方法,包括提取方法(超声、加热回流)、提取时间(30、60、90 min)、提取溶 剂(90%、70%、40%甲醇及无水甲醇),以各成分提取率为指标,最终确定为90% 甲醇超声提取60 min。然后,筛选不同流动相,包括甲醇-水(含0.2%甲酸)、乙腈-水(含0.2% 甲酸)、甲醇-水(含0.5%、0.4%、0.01% 磷 酸)、乙 腈-水(含0.5%、0.4%、0.01% 磷酸),发现水相中酸浓度较高时各成分分离度较好,色谱峰峰形明显改善,最终确定为乙腈-水(含0.4%磷酸)。最后,采用DAD 检测器在190~400 nm 波长处进行扫描,发现各成分在260、290 nm 处均有吸收峰,以前者更理想,最终确定为260 nm。

4 结论

本实验建立一测多评法同时测定沙芪浓缩丸中毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素5 种黄酮的含量,发现所得结果与外标法接近(相对偏差小于2%),可在相应对照品缺少或难以得到的情况下,以毛蕊异黄酮苷为内标实现含量测定的目的,从而为该制剂的质量控制提供参考。

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