抗黑胫病菌烟草内生真菌化学成分初步研究

马 骏，王茂胜，黄 鸿，郭亚利，高 贵，王 霞，马 莹

(1.贵州省烟草公司黔西南州公司，贵州 兴义 562400；2.贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州 贵阳 550003； 3.瓮福(集团)有限责任公司中低品位磷矿及其共伴生资源高效利用国家重点实验室/瓮福技术研究院，贵州 贵阳 550016； 4.贵州省烟草公司六盘水市公司，贵州 六盘水 553000)

0 引言

烟草是贵州省主要经济作物之一，是乡村振兴和财政收入的重要来源[1]。烤烟忌连作，由于土壤资源不足，连作经常发生，导致烟草根茎性病害严重发生[2]，再加上长期化学肥料和农药的施用，降低烟叶的产量和品质，对烟农收益造成很大的影响。因此，研究烟草土传病害的生物防治显得非常重要。植物内生菌(Endophytic bacteria)最初由德国植物学家De Bary[3]在1866年提出，后经过不断完善和发展，认为内生菌由一个多样性十分丰富的微生物类群组成，分布于没有外在感染症状的健康植物组织内，并与宿主植物协同进化[4]，有时产生相同或相近的活性成分的生物功能[5]，如，相关报道有内生菌有抗肿瘤[6]，抗黑胫病[7]等功能。

本文在前期对内生真菌资源分离、鉴定、筛选等的基础上，进一步采用气质联用法，对活性内生真菌(P.janthinellum)的化学成分进行初步研究，为烟草黑胫病的生物防治及下一步生物农药的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

内生真菌菌株经鉴定为P.janthinellum真菌，经对烟草黑胫病拮抗筛选，具有拮抗活性。保存于贵州理工学院。

黑胫病菌株P.parasitica来自贵州省烟草科学研究院。

马铃薯葡萄糖琼脂，配方见文献[8]。

试剂：甲醇、乙酸乙酯及培养基用试剂均为分析纯。

仪器： 安捷伦6890-5973 GC-MS气质联用仪。

1.2 实验方法

1.2.1 菌丝体获得及发酵液的制备

内生真菌菌株经活化后接入PDA培养基，进行培养。培养条件为：温度25 ℃，转速180 r/min，振荡培养72 h 。然后发酵液在10 000 r/min 下离心10 min，取菌丝体沉淀烘干备用；剩下部分为上清液，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 挥发性成分的粗提取

菌丝体烘干后，粉碎，甲醇提取三次，合并浓缩备用。

上清液用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，每次6 h，然后合并有机相，再用旋转蒸发仪减压蒸干，得到挥发性成分乙酸乙酯的粗提物。于4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.3 抗烟草黑胫病菌活性筛选

烟草内生真菌菌丝体和烟草黑胫病菌采取直接对峙培养，先用打孔器把事先培养好的内生真菌和黑胫病菌制成圆形菌碟，再把黑胫病菌碟培养在中心，接着把相同的2片内生真菌置于两旁对峙培养。25 ℃，5～7 d，观察黑胫病菌生长和抑制情况。

菌丝体甲醇提取物和上清液的乙酸乙酯提取物的活性检测方法一样，培养时先把黑胫病菌碟培养在中心，再将事先制作好的过滤纸圆片，分别蘸取菌丝体甲醇提取液或上清液的乙酸乙酯提取液，放置在黑胫病菌的周围进行对峙培养，25 ℃，5～7 d，观察黑胫病菌生长和抑制情况。

1.2.4 样品的检测

样品检测方法参照文献[9]，并根据实际情况作适当修改。气质联用(GC/MS)分析条件：色谱柱为HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱；柱温为 50 ℃(保留 2 min)，以 5 ℃/min 升温至 280 ℃，后保持 2 min；气化室温度为 250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；载气流量 1.0 mL/min；进样量1 μL；分流比10∶1；离子源为EI 源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量 70 eV；接口温度为260 ℃；溶剂延迟 3 min；分子量范围为50～550。

2 结果与分析

2.1 菌丝体与发酵液抗菌筛选

烟草内生真菌对黑胫病的拮抗作用情况如图1所示。图1中，A为内生真菌，B为菌丝体的甲醇提取物，C为上清液的乙酸乙酯提取物。由图1可看出，通过对峙培养方法，对拮抗菌的发酵液进行抗菌追踪，发现菌丝体对P.parasitica有拮抗作用；菌丝体甲醇提取物对P.parasitica有拮抗作用，而上清液乙酸乙酯提取物对P.parasitica的拮抗作用较弱。

图1 烟草内生真菌对黑胫病的拮抗作用

2.2 菌丝体甲醇提取物中化合物组成

采用GC-MS 方法分析烟草内生真菌P.janthinellum菌丝体的甲醇提取物的化学成分，得出内生真菌菌丝体甲醇提取物中共有20种成分，其中脂类8种，包括邻苯二甲酸二辛酯、丁内酯、棕榈酸甲酯、异硬脂酸甲酯、十八碳烯酸甲酯、十八碳二烯酸甲酯、酞酸二丁酯、十六碳酸酯，占40%；有机酸类9种，包括乙酸、尼克酸、十五烷酸、顺-9-十六碳烯酸、十七烷酸、蓖麻油酸、十八(烷)酸、顺-6-十八碳烯酸、亚油酸，占45%；酮类1种，二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮，占5%；其他2种，包括乙酰胺和环二十八烷，占10%。其中含量较高的三种物质分别为十六碳酸酯、顺-6-十八碳烯酸和亚油酸。相关情况分别如图2和表1所示。

图2 内生真菌菌丝体甲醇提取物质谱图

表1 内生真菌菌丝体甲醇提取物成分分析

由文献检索可知，菌丝体的甲醇提取物中十六碳酸和亚油酸含量较高，与制取抗菌素类药氯霉素的前体物质有关。崔君秀[10]指出十六碳酸酯是对小毛莨抗肿瘤有效部位的化学成分。王丽莎等[11]对泽漆的抗虫、抗菌活性进行研究，发现各组分中含量较高的组分有十六碳酸酯和亚油酸。龚兵等[12]从一株苦槛蓝内生真菌Trichodermasp.09中寻找有抗植物病原菌活性的化合物，利用硅胶柱层析分离到6个化合物，其中就有十六碳酸酯。陈荣林报道[13]，荞麦和苦荞麦内生真菌中抑菌抗肿瘤活性部位中含十六碳酸和亚油酸。李雅洁等[14]分析蒙山蜂胶挥发油组分，结果发现挥发油共鉴定出44种化合物，占色谱总馏出峰面积的93.12%，含量最高的组分为亚油酸23.91%，亚油酸用于合成第三代喹诺酮类抗菌药洛美沙星的前体，亚油酸具有保健功能，如降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂、心绞痛、冠心病、动脉粥样硬化、老年性肥胖症等的防治极为有利。结合本实验结果，进一步确认十六碳酸和亚油酸这两种物质在菌丝体甲醇提取物中的含量很高，且具有抗黑胫病菌作用，推测菌丝体的甲醇提取物中抗菌物质可能与十六碳酸和亚油酸有关，当然，对于活性物质的研究和开发需要进一步研究和验证。

由GC-MS 方法分析烟草内生真菌P.janthinellum上清液乙酸乙酯提取物的化学成分，得出其化学成分有18种，其中脂类5种，丙酸乙酯、醋酸正丙酯、醋酸丁酯、丙酸丙酯、酞酸二丁酯，占28%；有机酸类7种，乙酸、丙醇酸、苯甲酸、苯乙酸、棕榈酸、十八碳-6-烯酸、十八烷二烯酸，占39%；酮类1种为3-羟基-2-丁酮，占5.5 %；醇类2种，乙醇、丁二醇，占11%；醛类1种为十二烯醛，占5.5%；其他2种，包括3-乙基-2，5-甲基吡嗪和2-氧代乙酸乙酯肟，占11%。相关数据分别如图3和表2所示。经检索，该组分中未发现有关抗病的组分及前体物质。

图3 内生真菌液体上清液乙酸乙酯提取物质谱图

表2 内生真菌液体上清液乙酸乙酯提取物成分分析

3 结语

本文采用气质联用(GC/MS)法对抗黑胫病的内生真菌P.janthinellum的化学成分进行研究。结果显示：内生真菌菌丝体的甲醇提取物中共有20种成分，而液体发酵上清液的乙酸乙酯提取物中成分组成共有18种，而且成分也不同。

实验结果表明，菌丝体的甲醇提取物比发酵产物的乙酸乙酯的提取物的化学成分多2种。其中，菌丝体的甲醇提取物中十六碳酸和亚油酸含量较高，是制取抗菌素类药氯霉素的前体物质，推测可能具有抗菌或抗肿瘤活性。研究烟草内生真菌抗P.parasitica活性物质对于探索内生真菌抗菌机理和生物农药的开发具有很好的前景。