单细胞基因测序在肿瘤研究中的应用

香香 董辉 王利新

随着分子生物学技术快速发展，人们对肿瘤的发生机制以及细胞凋亡的了解与日俱增，也研究出了一些针对肿瘤分子靶向性的治疗药物，但其治疗效果并不理想。主要原因是对肿瘤的起始、进展及转移的机制只是一知半解，对于很多潜在的治疗性靶点的研究始终有所欠缺。传统的测序方法只能揭示聚集的混合细胞的特征，单细胞测序从一定程度上解决了传统测序固有的缺陷，包括单细胞基因组测序、转录组测序及表观遗传组测序，单细胞基因组测序可用来分析单细胞水平的点突变和拷贝数变异，用于揭示细胞群体差异、细胞进化关系等，可最真实的获得单克隆癌细胞的具体突变来源及精准的突变频率，单细胞转录组测序可对单细胞中mRNA 进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析，可以解决传统转录组测序技术在各研究领域中的样品量极低或细胞异质性的问题，表观遗传组测序可从单细胞水平获得全基因组范围内的甲基化水平数据，对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。本文将综述单细胞测序在肿瘤异质性、发病机制和治疗中的应用。

1 单细胞测序在肿瘤异质性的应用

肿瘤细胞会出现不同于正常细胞的代谢变化，并形成不同的谱系，导致肿瘤内异质性。单细胞测序在单个细胞层面进行高分辨率的分析，揭示单个细胞的状态和功能，准确的区分每个肿瘤组织中不同的细胞亚群。Dai 等［1］对大肠癌肿瘤的2 824 个细胞进行单细胞转录组测序分析，将其分为5 个不同的亚簇，发现不同亚簇对大肠癌肿瘤的相关性不同，其中三个簇参与细胞的外周工作，包括能量传递、细胞外基质生成等；其他两个簇中的基因更多地参与免疫过程。Yehuda 等［2］对小鼠胰腺进行了从侵袭前阶段到肿瘤形成过程中的单细胞转录组测序，鉴定了起源于腺泡细胞的acinar cells，对化生腺泡细胞异质性的进一步分析定义了6 种腺泡化生细胞类型和状态。乳腺癌（Breast cancer，BC）的组织学和分子分类正在被用于临床治疗。Yao 等［3］基于28 种免疫细胞类型的富集分数，对单细胞转录组测序数据进行聚类分析，确定了3 个BC亚型：BC-imh、BC-imm 和BC-iml，发现BC 中免疫反应强的肿瘤比免疫反应弱的肿瘤有更好的临床疗效，三阴性乳腺癌和人表皮生长因子受体2 阳性的BC 免疫原性更强，而激素受体阳性的免疫原性更低。单细胞测序技术的应用对肿瘤进行了更细致的临床分型以及发现了在肿瘤发展过程中起关键作用的细胞亚群，极大推动了肿瘤的分型。

2 单细胞测序在肿瘤免疫浸润的应用

免疫治疗使肿瘤治疗发生革命性改变，并使肿瘤免疫焕发出新活力。然而，肿瘤微环境的高度异质性和可变性阻碍了对肿瘤内免疫细胞的准确分离。随着单细胞测序的最新进展，使得系统地分析肿瘤微环境成为可能，并为解析肿瘤浸润免疫细胞的功能多样性提供机会。Dinh 等［4］对食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）的微环境细胞进行单细胞转录组测序分析，发现ESCC 基质细胞类型的异质性，确定了具有预后价值和潜在生物学意义的肿瘤特异性CST1+肌成纤维细胞亚群。Nathan 等［5］通过单细胞转录组测序绘制了31 例异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydrogenase，IDH）野生型和IDH 突变型胶质瘤患者的肿瘤浸润T 细胞的基因表达和克隆图谱，并发现CD161 和其他NK 细胞受体是免疫治疗的靶点。Zheng 等［6］在6 例肝细胞癌患者的外周血、肿瘤和邻近正常组织中分离的5 063 个单个T细胞中进行了单细胞转录组测序，鉴定了11 个T细胞亚群，亚群有自己的发育轨迹，如耗竭型CD8+T 细胞和Treg 细胞的优先富集和克隆扩增。Guo 等［7］通过单细胞转录组测序分析了来自3 例左右两侧大肠癌患者的27 927 个单个人类大肠癌细胞，结果发现了一个潜在的新的RBP4+NTS+癌细胞亚群，该亚群集中在左侧大肠癌，而左侧大肠癌的Treg 细胞水平较高，可能对免疫治疗有更高的反应性，并且发现M2 样巨噬细胞诱导的抗体依赖性细胞吞噬和毒性在左侧大肠癌中更为明显，与大肠癌的良好预后相关。肿瘤浸润免疫细胞对肿瘤细胞的调控和治疗发挥了关键的作用，进一步了解它在肿瘤组织中的作用机制能为肿瘤治疗提供十分重要的参考和帮助，而单细胞测序可以更细致的描述肿瘤免疫浸润。

3 单细胞测序在肿瘤免疫治疗的应用

免疫治疗的研发管线主要集中在组织水平的分子特征，对免疫治疗药物靶向的细胞和途径等机制缺乏透彻的了解，因此限制了临床试验的成功率。如果获得了免疫治疗前后靶细胞和作用途径的详细图谱，无疑可以大大促进免疫疗法的研究进展。Kwon 等［8］采用全外显子组测序联合单细胞转录组测序强调了单用彭布罗利珠单抗治疗的MSI-H 胃癌的反应异质性，显示不同的T 细胞受体与彭布罗利珠单抗的PFS 延长有关，yPD-1+CD8+T 细胞的增加与持久的临床益处相关。Foltz等［9］通过单细胞转录组测序发现对复发/难治性惰性非霍奇金淋巴瘤患者皮下注射N-803 和利妥昔单抗可诱导外周血NK 细胞和CD8 T 细胞持续增殖、扩张和激活，并且可以改变NK 细胞分子程序。Telli 等［10］通过单细胞转录组测序发现Tavo单药治疗CD8+t 细胞浸润增强的患者中表现为CXCR3-GS的富集，并表现出临床疗效，提示这种治疗方法可以增强抗原呈递并招募CD8 T 细胞，这是抗肿瘤疗效所必需的。总之，运用单细胞测序系统化地将细胞对比情况展示出来，可以获取肿瘤细胞的组合方式和基因数据，这些数据将为医生的诊断提供依据，为治疗肿瘤提供新思路，有针对性地开展治疗，判断患者接受治疗后的病情发展程度及预后情况。

4 单细胞测序研究肿瘤微环境的应用

在当前肿瘤研究中，肿瘤免疫微环境已成为重要的研究关注点。传统测序方法不能有效识别和描述肿瘤微环境中逐个免疫细胞的种类及其所处状态，可能掩盖了许多关键的信息。通过单细胞转录组测序，Kfoury 等［11］分析骨转移性前列腺肿瘤来定义微环境的不同特征，结果发现趋化因子CCL20 和CCR6 受体在髓样细胞中显著过度表达。Chen 等［12］通过单细胞转录组测序分析13 例前列腺肿瘤中的36 424 个细胞，确定了疾病侵袭性的上皮细胞，观察到了与微转移相关的KLK3 表达，并验证了癌细胞改变T 细胞转录组的能力，还发现了内皮细胞亚群在去势耐药前列腺癌中富集，并促进癌细胞侵袭。Chen 等［13］通过单细胞转录组测序分析膀胱癌肿瘤样本和肿瘤旁样本，在微环境中识别出19 种不同的细胞类型，发现肿瘤细胞下调MHC-II 分子以及单核细胞在肿瘤区域经历M2 极化并分化。Bartoschek 等［14］通过单细胞转录组测序分析乳腺癌基因工程小鼠模型中768 个间充质细胞，定义了三个不同的CAF 亚群，CAF 亚类的空间分离归因于不同的来源，包括血管周围生态位、乳腺脂肪垫和转化的上皮细胞。肿瘤微环境中的细胞成分已经成为肿瘤进展、治疗反应的关键调节剂，单细胞测序可以鉴定实体瘤内细胞的异质性，从而使实体瘤的临床诊治和转归预测变得更加准确。

5 单细胞测序在肿瘤精准治疗的作用

人类的疾病，大部分并不是基因组发生了改变，而是细胞发生了变化。单细胞测序能够对每一个细胞进行精准测量。Rao 等［15］对原发性小肠神经内分泌肿瘤与匹配的肝转移之间的细胞进行了单细胞转录组测序，分析显示，肝转移中的神经内分泌上皮细胞分化较低，SSTR2 表达相对较少，主要VEGF 受体的血管表达增高，这表明转移的血管系统准备扩张，容易受到血管生成抑制剂的治疗。Blombery 等［16］研究了89 例慢性淋巴细胞白血病患者在长期持续的venetoclax 治疗期间髓室是否出现临床和分子异常，单细胞基因组测序显示BAX与DNMT3A或ASXL1共发生克隆突变，同一患者的CLL 细胞中同时发生BCL2突变和髓室中BAX突变，表明对venetoclax 治疗有谱系特异性适应。总之，单细胞测序可以对个体化进行精准的诊疗，从而对患者的用药指导提供帮助。

6 单细胞测序在循环肿瘤细胞的应用

作为肿瘤进展的重要指标，对实体瘤患者外周血进行循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）单细胞测序分析有助于了解肿瘤的发生、发展。Zhao 等［17］通过单细胞甲基化组测序对CTC甲基组的综合分析，发现了一种独特的“CTC DNA甲基化特征”，分析表明，上皮基因的启动子甲基化是稳定的上皮-间充质转化过程的标志，有助于成为临床诊断的无创甲基化生物标志物。Malihi等［18］对有或没有侵袭性变异前列腺癌（Aggressive variant prostate cancer，AVPC）的患者在开始化疗前进行CTC 单细胞基因组测序，评估了CTC 基因组学与临床特征、无进展生存期和总生存期之间的关系，结果表明，CTC 的基因组不稳定性是晚期前列腺癌侵袭性的一个标志，并支持单CTC 测序作为非侵入性表征肿瘤异质性的一个有力工具。CTCs 是液体活检的主要靶点，是肿瘤预后的重要生物标志物，通常与不良临床结果有直接关系，也是研究肿瘤细胞转移机制的最适模型。

7 单细胞测序解释肿瘤转移和复发的分子机制

肿瘤转移和复发是肿瘤疾病最特殊的方式，往往导致临床治疗手段束手无策，Wang 等［19］通过单细胞转录组测序分析13 例低、高复发风险和复发性膀胱癌患者的肿瘤，结果发现，在膀胱癌复发期间，肿瘤干细胞亚群丰富，EZH2表达升高，从而使细胞侵袭性和干细胞转录程序失活。Carstens等［20］通过单细胞转录组测序发现Snail和Twist的联合基因抑制导致胰腺导管腺癌上皮稳定和肝转移增加，证明了上皮细胞的稳定导致癌细胞的集体迁移。利用单细胞测序鉴定肿瘤转移过程中的分子机制具有重要的研究价值，能够识别侵袭转移肿瘤细胞特有的基因突变，找出肿瘤发生转移的关键因子，为相关诊断生物标记物及靶向治疗药物的开发提供理论依据。

8 总结与展望

单细胞测序的发展改变了肿瘤研究的方法及角度，解决了一系列广泛的问题，能够在单个细胞水平研究肿瘤的内部异质性、剖析肿瘤微环境及追溯肿瘤细胞源性，揭示肿瘤细胞转移和复发的机制。然而，单细胞测序作为一项新兴技术，仍存在较多的局限，如扩增偏倚、等位基因脱扣、假阳性率及高额成本等，但随着SCS 技术不断改进，成本降低及在单细胞水平上对异质性细胞群体进行的研究，学者们今后可更准确、快速地识别肿瘤相关突变基因及克隆构型，揭示发病及克隆演变机制，为肿瘤的诊断与治疗提供指导。