病毒宏基因组在医学上的应用与未来展望

梁志坤 李可胜 蒋析文

感染性疾病仍是危害人类健康和全球公共卫生安全的重要问题，而感染性疾病有许多来源于病毒。根据以往的经验来看，发现和鉴定新病毒以及确定新病毒与疾病的关系是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。传统意义上有很多用于发现新病毒的方法，如病毒分离、核酸检验、血清学试验等，但是这些方法有较大的局限性。21世纪以来，随着测序技术快速发展，尤其是下一代测序技术（Next-generation sequencing technology，NGS）的广泛应用和新兴学科宏基因组学（Metagenomics）的出现为探索未知病毒提供了技术支持和理论依据。此外，但是近些年随着人类基因组和微生物组深入研究表明，病毒与人体之间存在更广泛的相互作用，并且有希望应用在临床治疗上。本文主要就近些年来对病毒宏基因组的兴起与发展，研究的策略以及在医学上的一些应用前景进行综述，并提出病毒宏基因组的一些未来展望。

1 病毒宏基因组的发展由来

宏基因组学于20世纪90年首次由Schmidt等［1］提出，最初是应用于海洋微生物的研究。直到2003年，Breitbart M 才首次将病毒宏基因组应用于人粪便中病毒信息研究，结果发现了大量的新的基因型病毒，并揭示存在人体中的新病毒与人类疾病可能的关系［2］。病毒宏基因组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具有重要作用。截至2018年，已知来自25 个病毒家族约263种病毒可以感染人类，但是，这只占到所有可能感染人类病毒的不到0.1%，还存在大约167 万种病毒尚未被发现，而在这167 万种病毒中被估计大概有63.1 万至82.7 万种病毒有可能感染人类［3］，这说明对病毒的研究具有非常广阔的前景和现实意义。此后，一个国际研究团队，通过广泛地研究脊椎动物，包括鱼类、两栖动物和爬行动物，发现了超过200 种以前不为人知的病毒，而且某些病毒能够导致包括流感和出血热等在内的疾病［4］，进一步证明了许多未知的病毒可能感染人类。

2 宏基因组的研究策略

2.1 靶向mNGS 分析

靶向mNGS 指的是靶向富集样本中特定类型的微生物，通过增加序列数据中病原体读取的数量和比例来提高对目标微生物的检测灵敏度的一项技术。目前，靶向富集主要有几种思路：①设计特定的引物来靶向扩增：这种靶向扩增可以是特定区域，例如16s/18s［5-7］；也可是横跨整个基因组的，例如完整病毒扩增［8-9］。②设计捕获探针富集［10］，即通过捕获探针富集对文库进行杂交。这些技术被证明在研究环境中提高了宏基因组检测的灵敏度，特别是对于病毒。比如，Deng 等［11］设计的带有靶向引物富集（MSSPE）的宏基因组测序，该方法相比于普通mNGS 可富集目标RNA 病毒序列含量约10 倍，同时保留对其他病原体的宏基因组敏感性。Hayden 等［12］提出了一种计算方法（CATCH），可实现完整病毒基因组探针的设计，高效用于病毒检测、序列捕获，有助于实现更敏感和更经济有效的宏基因组捕获测序。

2.2 非靶向mNGS 分析

非靶向mNGS 放弃使用特异性引物或探针，针对环境样本中全部DNA 和/或RNA 进行测序。临床样本的非靶向mNGS 可能是综合诊断感染最有希望的方法。原则上，几乎所有的病原体，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫，都可以在一次检测中识别。但是这种策略的一个局限性就是其灵敏度严重依赖于背景水平，这种情况尤其在组织样本中特别明显，因为不同于无细胞体液，组织的样本增加了人类宿主背景，导致微生物读长的数量和比例减少，从而降低了对mNGS 的敏感性［13］。此外，从一些复杂的样本如呼吸道分泌物、粪便等中鉴定或者诊断与疾病相关的微生物也比较困难［14］。目前，非靶向mNGS 已经有不少在临床实验室成功诊断感染的案例，包括脑膜炎或脑炎、脓毒症和肺炎等［15］，这些案列可以对实际临床试验提供宝贵的参考价值。

3 病毒宏基因组在医学上的应用

3.1 在临床病原检出中的应用

目前，临床上尚有一些病因不明的急性或慢性感染性疾病，给特异性诊疗带来了巨大困难。相对于传统的病原诊断方法，病毒宏基因组技术自发展以来，在临床病原的鉴定上发挥了极大的优势。目前，已经有大量的研究将病毒宏基因组学应用于临床并成功地进行病原体检测［16-21］。比如近些年，有许多病毒展现出具有感染神经系统的潜力，临床多表现为脑炎，研究人员通过宏基因组技术成功地鉴定出了这些病毒，其中包括埃博拉，寨卡，基孔肯雅，浓核，卡什谷，西尼罗和玻瓦桑病毒等［16-19，22-23］。宏基因组因其测序具有无偏倚性、高覆盖和高效性的特点，使得与其他检测技术如多重PCR、检测芯片等相比，其在某些样本中病毒感染的诊断有更高的检出率，且能发现被遗漏未检出的病毒［20-21］，说明了病毒宏基因组在临床上病原的鉴定具有很大的优势。

3.2 在公共卫生领域的应用

病毒宏基因组还在公共安全卫生方面发挥着重要作用。历史上，利用宏基因组测序技术研究人员已经成功鉴定多起由病毒引起的流行病，比如由埃博拉病毒引起的乌干达出血热［24］，H1N1 型流感病毒引起的猪流感［25］、寨卡病毒感染疫情［26］和H7N9 流感病毒疫情［27］等。此外，通过追踪溯源发现许多病毒很可能来源于动物，表现出病毒向人类快速扩张的迹象。比如在2019年新冠爆发初期，Wu 等［28］利用宏基因组技术，从新冠肺炎病人的支气管肺泡灌洗液中检测出了病原体，并通过的与之前的SARS 病毒比较，最终确定了这是一种全新的冠状病毒SARS-CoV2，为全世界迅速展开冠疫防控、开发诊断试剂和疫苗提供不可或缺的基础。因此，加大病毒宏基因组在全球的广泛应用将有助于我们更加了解病原感染信息，提供预防措施信息和防控疫情。

3.3 在临床治疗上的应用

以往大多数的病毒宏基因组研究都集中在有害病原的检测当中，但是人体中还存在着一种感染细菌的病毒-噬菌体。噬菌体约100年前被发现，人们对噬菌体的研究极大的改变了生命科学的基础认知和相关研究［29］。近些年的研究表明噬菌体在人体健康中也可能发挥着重要的作用。例如，在某些疾病如炎症性肠炎以及多种类型糖尿病患者肠道内，其噬菌体的含量和种类都有明显的差异，揭示肠道噬菌体组和一些疾病可能产生关联［30-32］。更令人兴奋的是，研究人员发现对小鼠通过粪便病毒体的移植可以减少Ⅱ型糖尿病和肥胖症状［33］。相信通过宏基因组技术，未来可以非常清楚噬菌体在其环境中的作用，并且可以通过移植噬菌体来获得对某些疾病的治疗。此外，利用噬菌体可以特异感染并杀死细菌的特性，在临床上可用噬菌体来控制、治疗超级耐药菌的感染，并且已经有了相关成功的案例［34］，这将有助于人类进入后抗生素时代［35］。目前对于噬菌体的鉴定非常依赖于公共数据库中收录的噬菌体信息，但是据统计，在2020年之前公共数据库噬菌体的数量还不超过1 万株，而据报道一个人的肠道里面就有1015-16个，所以对噬菌体的认识还远远的缺乏。而通过宏基因组技术可以从复杂的样本中获得噬菌体的基因组序列，并针对特定病原菌构建更多有效的专一噬菌体数据库，为临床上噬菌体的应用提供支持。例如，最近研究人员就通过宏基因组技术构建起迄今最大的人类肠道噬菌体基因组数据库（GPD）［36］，获得约14.2 万个人肠道噬菌体，大大地丰富了噬菌体的数据库。

4 病毒宏基因组局限性

宏基因组学作为一项新的技术，在许多临床实验中被证明是病原检测的有效工具，特别是在病毒学当中得到了很好的应用。但是，目前病毒宏基因组还存在着一些局限性：①病毒宏基因组在样本处理的时候由于过滤可能会损失一些病毒粒子，为后续分析增加难度；②病毒宏基因组的基因组比真核和原核基因组小，更容易受测序偏好的影响，有可能在实验过程引入外源核酸污染；③宏基因组的样本在取样过程中，病毒的完整性和覆盖度，容易受到随机引物和扩增结果的影响；④病毒宏基因组数据库信息缺乏，大量的病毒序列无法匹配到数据库；⑤病毒宏基因组需要处理海量的测序数据，并且仍然缺乏一些统一标准的生物信息处理工具。

5 未来与展望

在过去十几年，病毒宏基因组被证明在公共卫生和传染病防控方面发挥着重要的作用。目前，我国的宏基因组技术在临床的应用也正在完善规范的管理以及相关技术标准的制定，并且随着测序成本持续降低，测序规模更大，该技术在医学上的应用将越来越广泛。此外，随着研究的深入，未来将会产生了大量的测序数据，这些数据将不限于单一的宏基因组数据，而是将宏基因组学与宏转录组学、宏蛋白组学等技术结合起来在多组学研究的层面上探索环境微生物的多样性以及与人类健康的关系。