HPLC法测定柳蘑麦角甾醇含量

尹昭晔 孔炯炜 赵 婷 赵引利 刘 湘 乔丽菲

（武安市第一人民医院，河北武安 056300）

柳蘑学名毛栓菌Trametes hirsute，属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科[1]，是民间习用的治癣菌类生药，具有消炎解毒、止痒的功效，其油膏剂已收入《卫计委药品标准中药成方制剂第十五册》，用于治疗牛皮癣、干癣、风癣及神经性皮炎[2]。柳蘑治疗癣症疗效确切，但药效物质基础尚不明确，未有合理质控方案，目前未见关于柳蘑的药效成分含量测定研究报道，为了更好地控制药材质量，现采用高效液相色谱法测定其药效成分含量，以有效地控制药材的质量。

麦角甾醇是真菌类的特征甾醇。据报道，麦角甾醇的量与真菌的生物量存在相关关系，是真菌生物量的重要标志物之一[3-5]，药理作用广泛，现代药理研究表明其具有良好的抗炎抗菌作用[6-10]。因此，笔者以麦角甾醇为指标成分，测定其含量，为完善柳蘑药材和制剂的质量标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

U-3000 型高效液相色谱仪（配置四元泵，紫外检测器，化学工作站，美国戴安公司）；XS105型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂

柳蘑（天津达仁堂京万红药业有限公司提供）；麦角甾醇（中国食品药品检定研究院，批号：111845— 201604；质量分数：96.2%）；色谱级甲醇（德国默克公司）；水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：DIKMA C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：100%甲醇；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃；进样体积：10µL；检测波长：282 nm。

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取麦角甾醇标准品11.67 mg，用无水甲醇定容至10 mL 容量瓶中，超声2 min 使其溶解完全，制备成1.123 mg/mL的对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备

1.3.3.1 麦角甾醇化合物制备

称取预粉碎的毛栓菌药粉4.0 kg，95%乙醇超声提取2 次，1 h/次，每次溶剂用量均为20 倍量（kg/L），合并两次提取液，滤过，60 ℃减压回收溶剂至完全回收乙醇，得浓缩液；将浓缩液用超纯水1∶1稀释，用等体积的乙酸乙酯萃取3 次，合并3 次萃取液，低温回收溶剂至干，得乙酸乙酯萃取干膏42 g；经硅胶柱色谱，用石油醚-丙酮梯度洗脱，洗脱液中有大量无色针晶析出，滤过分离晶体与母液，得到混合物618 mg，制备色谱柱SHIM-pack PRC-ODS（20 mm×250 mm，5µm），二极管阵列检测器，检测波长为203 nm，柱温为室温，98%甲醇-水洗脱，流速为3 mL/min；做分离制备，回收制备液低温干燥得到4种纯品化合物，均为麦角甾类化合物[11]，并作为样品。

1.3.3.2 供试品溶液制备

精密称取柳蘑样品约2.00 g，置具塞锥形瓶中，精密加入100 mL无水甲醇，并封口浸泡过夜，超声提取1 h（40 kHz 500 W）冷却至室温，用无水甲醇补足，用0.45µm微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

参考相关文献[12]，得知麦角甾醇在紫外吸收区的最大吸收波长为282 nm，故采用282 nm 为检测波长。

2.2 流动相的选择

试验先后采用甲醇-水体积比（100∶0、98∶2、95∶5）及乙腈-水体积比（98∶2、95∶5）作为流动相进行测定，发现100%甲醇作为流动相，保留时间最短，为20 min，且能达到色谱峰形对称，不拖尾，分离完全，故最终确定以100%甲醇作为流动相进行洗脱。

2.3 系统适应性及线性关系考察

按1.3.1色谱条件进行供试品及对照品HPLC检测，供试品与对照品在相同的保留时间处有相应的色谱峰，且与杂质峰得到较好的分离，分离度大于1.5（图1）。

图1 麦角甾醇对照品溶液（A）和供试品溶液（B）HPLC色谱图

精密称取麦角甾醇标准品，用流动相溶解并稀释成每1 mL 含麦角甾醇分别为22.5µg、44.9µg、112.3µg、224.5µg、449.1µg、1 122µg 的对照品溶液，分别取10µL 进样，麦角甾醇色谱峰面积分别为372 709、708 874、1 593 605、3 379 179、6 957 211、16 995 928，以麦角甾醇含量（µg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，回归方程为y=15 169x+5 842，R2=0.9998，表明麦角甾醇在0.022 5～1.122 7 mg/mL线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液10µL，按照1.3.1 色谱条件进行测定，重复进样6次，麦角甾醇的峰面积RSD为0.67%，表明该方法精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一批次柳蘑样品，按照1.3.3制备供试品溶液，分别在供试品溶液制备好后的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 进样，计算峰面积RSD 为1.56%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6 重现性试验

取同一批次柳蘑样品，精密称取1.000 g，平行称量6 次，按照1.3.1 色谱条件进行测定，测得麦角甾醇的平均含量为1.718 mg/g，计算RSD 为1.29%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取柳蘑样品2 g，平行6 次，精密称量，按照1.3.3制备供试品溶液，并进行测定，计算回收率。测得平均回收率为100.48%，RSD为1.38%。表明加样回收率良好（表1）。

表1 加样回收率试验结果

2.8 样品含量测定

精密称取一定质量的柳蘑样品，制备供试品溶液，按1.3.1 色谱条件进行测定。供试品溶液进样5次，以外标法中的标准曲线法计算柳蘑药材样中麦角甾醇成分的含量。计算得柳蘑麦角甾醇含量为1.719 mg/g。

3 小结

试验建立了柳蘑中麦角甾醇的HPLC 测定方法，测定方法简便且重现性好，可作为柳蘑中抗菌成分麦角甾醇含量的测定方法，为完善柳蘑药材和制剂的质量标准提供依据。