基于RANKL/RANK/OPG信号通路探讨土贝母苷甲对糖尿病性骨质疏松大鼠骨质流失的影响

杨晓净 邓向群 肖婷 杨梅

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是较常见的代谢性骨疾病，以骨微结构破坏、骨量降低为特征，可增加骨脆性与骨折风险，影响患者健康并增加经济负担[1]。继发性OP常由代谢类疾病引起，糖尿病是导致OP的主要原因之一，随着糖尿病进展，胰岛素抵抗与内环境紊乱均可引起骨代谢异常，增加OP风险[2]。糖尿病性OP治疗包括生活方式干预、控糖，但收效甚微，因此急需发现安全有效的糖尿病性OP治疗药物。土贝母苷甲是五环三萜皂苷家族的成员，从中草药土贝母中提取，传统用于治疗蛇毒与炎症；且土贝母苷甲具有广泛的抗癌特性[3]。此外，研究显示土贝母苷甲可抑制NF-κB保护小鼠急性肺损伤[4]。而NF-κB通路对于破骨细胞的形成和分化是必不可少，NF-κB是RANKL诱导破骨细胞分化的重要下游信号[5]，然而土贝母苷甲对OP的直接影响笔者发现尚未被研究。因此，本研究笔者所见通过破骨细胞分化的常用通路RANKL/RANK/OPG探讨土贝母苷甲对糖尿病性OP的影响，为糖尿病性OP的临床治疗提供理论参考。报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物 2个月龄Wistar大鼠60只(雄性)，许可证号：SCXK(湘)2019-0015，购自长沙市天勤生物技术有限公司。自然昼夜节律光照(12 h，12 h)，自由饮食饮水，环境湿度为40%～70%。

1.2 试剂 土贝母苷甲(S27647，纯度≥95%，溶于二甲基亚砜中)；OPG(SRP3132)购自默克生命科学官网；SuperScriptTMIV第一链合成系统(18091050)、EXPRESS One Step SuperscriptTMqRT-PCR试剂盒(11781200)购自赛默飞世尔科技公司；兔抗RANK、RANKL、OPG、GAPDH一抗(GTX133795、GTX108515、GTX127948、GTX627408)购自GeneTex，山羊抗兔二抗(ab6702)购自美国Abcam公司；大鼠核心结合因子α1(CBF-α1)(GT04504B)ELISA检测试剂盒购自上海晶风生物科技有限公司；Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)(ml038224)、骨钙素(OC)(ml002883)ELISA检测试剂盒购自上海酶联；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)(HR0561)购自北京百奥莱博科技有限公司；HE染色试剂(G1120)、BCA试剂盒(PC0020)均购自北京索莱宝。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备：Wistar大鼠适应性喂养2周后，随机抽取10只作为对照组，其他大鼠均构建糖尿病性OP模型[6]，即大鼠以高糖高脂饮食喂养(常规饲料+20%蔗糖+15%熟猪油、2.5%胆固醇)，禁食12 h后，腹腔注射链脲佐菌素(0.2%，25 mg/kg，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为稀释液)，连续注射5 d。造模后第7天清晨尾静脉取血测定血糖，血糖值>16.7 mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。对照组常规饮食，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液代替。5周后通过全自动双能X线骨密度测量仪检测所有Wistar大鼠骨密度(BMD)，模型组以BMD<对照组平均BMD 2.5个标准差为糖尿病性OP大鼠造模成功。

1.3.2 分组：将符合条件的模型大鼠随机分为模型组、土贝母苷甲低剂量组、土贝母苷甲高剂量组、OPG组、土贝母苷甲高剂量+OPG组，每组10只。土贝母苷甲低剂量组、土贝母苷甲高剂量组分别每日腹腔注射1 μmol/L、5 μmol/L土贝母苷甲[7]；OPG组尾静脉注射3 mg/kg的OPG[8]；土贝母苷甲高剂量+OPG组腹腔注射5 μm土贝母苷甲，尾静脉注射3 mg/kg的OPG；模型组以二甲基亚砜代替。

1.3.3 ELISA法检测大鼠骨代谢指标(血清CBF-α1、PINP、OC)水平：末次给药后，戊巴比妥钠对大鼠实施麻醉，经腹主动脉取血，分离得血清，ELISA法测定大鼠血清CBF-α1、PINP、OC水平，均严格参照ELISA试剂盒操作说明书。

1.3.4 Micro-CT测定骨密度及骨小梁微结构参数：随机抽取5只大鼠，分离大鼠右侧股骨，将股骨标本固定，使用Micro-CT对股骨远端干骺端进行扫描，扫描完成后，对测量区域进行重组获得3D图像，利用ABA2.0对数据进行定量分析，得到BMD、骨体积分数(BV/TV，感兴趣区内骨组织体积除以总体积)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)，均由同一组熟练研究人员完成。

1.3.5 三点弯曲试验检测大鼠股骨机械强度：将大鼠中段股骨放置到OTS-15型分析仪上，对其进行三点弯曲试验，记录载荷-变形曲线，并计算最大载荷和断裂挠度。

1.3.6 TRAP染色：剥离1.3.4中大鼠左侧股骨，按照TRAP染色试剂盒说明制备染色溶液。将石蜡包埋的切片进行脱蜡并水化，将其浸泡在37℃的预热的染料液浸染1 h，用蒸馏水洗涤，再次染色1 min。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，封片。细胞核被染成蓝色，TRAP的阳性表达表现为在细胞质中出现亮红色或深红色颗粒。具有≥3个核的TRAP阳性多核细胞被认为是破骨细胞，观察并计算大鼠破骨细胞数量(N.Oc/BS)。

1.3.7 HE染色观测大鼠骨组织病理学：分离剩余5只大鼠左侧股骨，经甲醛(10%)固定后，脱钙、常规脱水、透蜡、包埋、切片，行HE染色，于光学显微镜下观察。

1.3.8 qRT-PCR法检测大鼠骨组织RANKL、RANK、OPG mRNA水平：取适量1.3.7中各组剩余5只大鼠右侧股骨组织，利用Trizol抽提试剂盒抽提组织总RNA，反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。反应条件：95℃预热3 min，95℃ 变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共35次循环，72℃ 5 min终止反应。RANKL/RANK/OPG以GAPDH为内参基因[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。通过2-ΔΔCt法计算RANKL、RANK、OPG mRNA相对表达量。见表1。

表1 引物序列

1.3.9 Western Blot法检测骨组织RANKL/RANK/OPG通路蛋白表达：取1.3.8中剩余右侧股骨组织，匀浆后蛋白裂解液裂解，离心后取上清，BCA法检测蛋白含量，按一定比例(4∶1)加入样品缓冲液，95℃煮沸5 min，离心后取上清进行SDS-PAGE电泳。转膜(PVDF膜)、封闭2 h。加入RANKL、RANK、OPG、GAPDH(内参)一抗(稀释比分别为1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000)，4℃孵育过夜，洗膜加入二抗37℃孵育2 h，洗膜。ECL显影，测定各蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 6组大鼠血清骨代谢标志物的表达情况比较 与对照组相比，模型组大鼠血清CBF-α1、PINP、OC水平降低(P<0.05)；与模型组相比，土贝母苷甲低剂量组CBF-α1、PINP水平升高，土贝母苷甲高剂量组、OPG组血清CBF-α1、PINP、OC水平升高(P<0.05)；与土贝母苷甲高剂量组相比，土贝母苷甲高剂量+OPG组血清CBF-α1、PINP、OC水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 6组大鼠血清骨代谢标志物的含量比较

2.2 6组大鼠股骨机械强度比较 与对照组相比，模型组大鼠股骨最大负荷、断裂挠度降低(P<0.05)；与模型组相比，土贝母苷甲高剂量组、OPG组大鼠股骨最大负荷升高(P<0.05)；与土贝母苷甲高剂量组相比，土贝母苷甲高剂量+OPG组大鼠股骨最大负荷升高(P<0.05)。见表3。

表3 6组大鼠股骨最大负荷和断裂挠度比较

2.3 6组大鼠骨密度及骨小梁微结构参数比较 与对照组相比，模型组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，Tb.Sp升高(P<0.05)；与模型组相比，土贝母苷甲低剂量组、土贝母苷甲高剂量组、OPG组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)；与土贝母苷甲高剂量组相比，土贝母苷甲高剂量+OPG组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)。见表4。

表4 6组大鼠骨密度及骨小梁微结构参数比较

2.4 6组大鼠骨组织形态的变化 对照组大鼠可见完整骨小梁形态，结构清晰，排列整齐且网状；模型组大鼠骨小梁数量明显减少且出现断裂，排列疏松，孔隙变大；土贝母苷甲低、高剂量组、OPG组可见新生骨小梁，数量有所增多，形态相对完整；土贝母苷甲高剂量+OPG组骨小梁形态进一步恢复。见图1。

对照组 模型组 土贝母苷甲低剂量组

2.5 6组大鼠骨组织RANKL/RANK/OPG通路相关蛋白的表达比较 与对照组相比，模型组大鼠骨组织OPG mRNA与蛋白表达降低，RANKL、RANKmRNA与蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组相比，土贝母苷甲低剂量组、土贝母苷甲高剂量组、OPG组大鼠骨组织OPG mRNA与蛋白表达升高，RANKL、RANK mRNA与蛋白表达降低(P<0.05)；与土贝母苷甲高剂量组相比，土贝母苷甲高剂量+OPG组大鼠骨组织OPG mRNA与蛋白表达升高，RANKL、RANK mRNA与蛋白表达降低(P<0.05)。见图2，表5。

表5 6组大鼠骨组织RANKL/RANK/OPG通路相关蛋白的表达

图2 6组大鼠骨组织RANKL/RANK/OPG通路相关蛋白的表达;A 对照组；B 模型组；C 土贝母苷甲低剂量组；D 土贝母苷甲高剂量组；E OPG组；F 土贝母苷甲高剂量+OPG组

2.6 6组大鼠骨表面破骨细胞数量 与对照组相比，模型组大鼠破骨细胞/骨表面的平均数量(N.Oc/BS)增多(P<0.05)；与模型组相比，土贝母苷甲高剂量组、OPG组大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05)；与土贝母苷甲高剂量组相比，土贝母苷甲高剂量+OPG组大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05)。见图3，表6。

对照组 模型组 土贝母苷甲低剂量组

表6 6组大鼠骨表面的破骨细胞数量比较

3 讨论

骨骼内稳态是基于成骨细胞与破骨细胞的微妙平衡介导的，成骨/破骨细胞的失衡会破坏骨微结构，造成OP。OP是糖尿病的主要并发症之一，可能是由胰岛素抵抗造成的内分泌失调导致，增加患者脆性骨折风险，这通常带来发病率与危及生命的死亡率升高，并带来沉重的经济负担。对糖尿病性OP的治疗方法以及发病机制进行研究有其临床意义。

本研究通过高脂高糖饮食+腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病性OP模型，发现血糖值>16.7 mmol/L，BMD<对照组平均BMD 2.5个标准差，提示造模大鼠符合本研究试验条件。

近年来，中药在药物开发方面做出了突出贡献。诸多研究证实中药复方或中药提取物靶向破骨细胞是治疗OP的重要方法，如当归补血汤[9]、葛根芩连汤[10]、绞股蓝总皂苷[11]等。土贝母苷甲是从中药土贝母中提取的活性物质，被证明有抗肿瘤特性，如土贝母苷甲可通过诱导活性氧介导的自噬溶酶体累积受损增加结直肠癌细胞对化疗敏感[12]。土贝母苷甲对破骨细胞有一定保护作用，Wang等[4]研究显示，土贝母苷甲可通过抑制破骨细胞分化对去卵巢模型小鼠的OP有保护作用。何峰等[13]研究显示，涤痰散结药物在类风湿关节炎中有应用，土贝母是其中发挥药效的药物之一。

本研究发现，模型大鼠BMD明显降低、骨小梁微结构受损严重。土贝母苷甲低高剂量组大鼠BMD升高，骨小梁微小结构部分恢复，血清CBF-α1、PINP、OC含量升高，三点弯曲结果显示OP大鼠的最大负荷和断裂挠度显著升高。CBF-α1、PINP、OC是骨代谢中的关键标志物，CBF-α1是成骨细胞分化的关键转录因子，血清PINP含量可反应1型胶原合成速率与骨转换情况；血清OC与骨组织OC正相关[14]。Micro-CT能够很好的评价骨小梁微结构，TRAP染色可评估破骨细胞数目，本研究发现土贝母苷甲处理后大鼠骨小梁微结构参数BV/TV、Tb.N、Tb.Th明显增加，Tb.Sp和N.Oc/BS明显降低，提示土贝母苷甲可能通过抑制破骨细胞的生成，有效改善OP大鼠的骨代谢失衡和骨微结构。

RANKL/RANK/OPG通路在破骨细胞的发展中发挥关键作用，RANKL/RANK相结合可促进破骨细胞的活化以实现体内平衡与宿主防御，OPG可与RANK竞争RANKL，进而抑制破骨细胞生成[15,16]。Li等[17]研究发现RANKL刺激后，激活ERK、p38和JNK、MAPK磷酸化促进破骨细胞成熟，抑制此通路可有效抑制破骨细胞成熟和骨吸收。

本研究发现，与对照组相比，模型大鼠骨组织RANKL、RANK mRNA水平与蛋白水平均升高，OPG mRNA水平与蛋白水平均降低，土贝母苷甲处理大鼠骨组织RANKL、RANK mRNA水平与蛋白水平较模型组降低，而OPG mRNA水平与蛋白水平较模型组升高，外源性OPG与土贝母苷甲处理发挥相同作用。在土贝母苷甲高剂量组基础上添加OPG，大鼠骨组织RANKL、RANK mRNA水平与蛋白水平进一步升高，OPG mRNA水平与蛋白水平进一步降低，提示土贝母苷甲可能通过抑制RANKL/RANK/OPG通路发挥预防糖尿病性OP大鼠骨质流失作用。

综上所述，土贝母苷甲可能通过抑制RANKL/RANK/OPG通路，减少糖尿病性OP大鼠破骨细胞形成，抑制骨流失，缓解OP。