烟草秸秆绿原酸提取工艺优化及其抑菌效果研究

张豫丹 王卫民 倪博 马晓寒 李俊领 许自成 贾玮 史久长

摘要：为扩展烟草秸秆的利用途径，探究烟草秸秆绿原酸对烟草疫霉的抑菌效果，采用单因素试验和响应面分析法优化烟草秸秆绿原酸微波辅助提取工艺，并通过离体培养探讨烟草秸秆绿原酸对烟草疫霉菌的抑制作用。单因素及响应面结果表明，烟草秸秆绿原酸最佳提取工艺为料液比1∶15（g·mL-1），提取温度50.03 ℃，乙醇体积分数50%，此时粗提物中绿原酸含量为3.48 mg·g-1；离体条件下，烟草秸秆绿原酸的添加均抑制了疫霉菌的生长，其中175 mg·L-1烟草秸秆绿原酸对菌落直径的抑制效果最为显著，抑菌率高达32%。此外，碘化丙啶（PI）染色结果表明，175 mg·L-1的烟草秸秆绿原酸可通过破坏烟草疫霉菌细胞膜的完整性抑制菌丝生长。研究结果为烟草秸秆有效利用和新型天然植物源杀菌剂开发奠定了基础。

关键词：烟草秸秆；绿原酸；响应面优化；抑菌效果doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0888

中图分类号：S38 文献标志码：A 文章编号：10080864（2023）01011909

烟草，茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana）植物[1]，是一种重要的叶用经济作物[23]。我国是世界上最大的烟草生产国，每年烟草生产量占世界总量的40%[4]。烟草秸秆（以下简称烟秆）是烟草生产中占比最高的农业废弃物，我国年产烟秆高达270万t[5]。由于烟秆成分复杂，所含木质纤维素和尼古丁不易被微生物分解，还田处理困难，烟秆焚烧不仅造成大量生物资源浪费，还造成严重的环境污染[67]。因此，亟需寻找新的利用方式。

绿原酸（chlorogenic acid， CGA）是植物经莽草酸途径产生的一种次生代谢物质[8]，素有“植物黄金”的美称[9]，具有抑菌、抗氧化等多种生物活性[1011]。研究表明，绿原酸可诱导活性氧的积累，导致藤仓镰孢菌（Fusarium fujikuroi）死亡，进而降低圣女果采后腐烂病的发生[12]。此外，绿原酸通过破坏真菌细胞膜的通透性对核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）、番茄镰刀菌（Fusarium solanieumartii）、黄萎病菌（Verticillium dahliae）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等病原真菌产生抑制作用[13]。

绿原酸是烟草中含量较高的多酚类化合物，占烟草总多酚含量的75%～95%[14]，目前有关烟草绿原酸的研究大多集中在烟叶上，而烟秆的绿原酸鲜有报道。本研究以烟草秸秆为原料，采用微波辅助提取工艺，结合响应面法进行优化，并以烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）为对象检测烟秆绿原酸的抑菌效果，以期实现资源的良性循环利用。此外，研究结果也有助于烟草的多用途利用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

烟草品种为‘秦烟96，秸秆取自洛阳植烟区；绿原酸标准品购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇等试剂为国产分析纯。受试菌株为本实验室保存的烟草疫霉菌。

1.2 方法

1.2.1 烟草秸秆样品的预处理 将烟草秸秆在105 ℃杀青15 min，80 ℃烘干至恒重后冷却，用粉碎干燥机将秸秆粉碎后过60目筛，装入自封袋保存备用。

1.2.2 绿原酸标准曲线的绘制 准确称取绿原酸标准品10 mg，用纯水完全溶解后定容至100 mL容量瓶中，分别吸取绿原酸标准品5.00、7.50、10.00、12.50、15.00、17.50、20.00 mL 置于7 个100 mL容量瓶中，用纯水定容后摇匀，以纯水为对照，在最大吸收波长327 nm处测其吸光度。以吸光光度值为Y 轴；绿原酸质量浓度为X 轴，绘制标准曲线。

1.2.3 烟草秸秆中绿原酸提取单因素试验 将乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间作为考察因素，固定提取温度50 ℃、提取时间30 min、乙醇体积分数50%、料液比1∶10 （g·mL-1）、微波时间180 s，设计乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%；料液比（g·mL-1）为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取温度为40、50、60、70 ℃；提取时间为60、80、100、120 min。依据单因素试验结果，选取料液比（A）、乙醇体积分数（B）、提取温度（C）为自变量，利用Design Expert 8.0.6软件进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合试验设计，对烟草秸秆中绿原酸提取条件进行优化。因素水平见表1。

绿原酸含量=（C × V/W）×10-3 （1）

式中，C 为根据回归方程计算得出的綠原酸质量浓度，mg·L-1；V 为提取液体积，mL；W 为烟草秸秆干质量，g。

1.2.4 优化烟草秸秆中绿原酸提取工艺 使用Design Expert 8.0.6软件对响应面试验数据进行分析，最终获得烟秆中绿原酸的最佳提取条件。

1.2.5 OA培养基制备 对照组：将30 g燕麦加水煮烂（25 min 左右，燕麦膨胀微微裂开即可），用4层纱布过滤于烧杯中，加水补足至1 000 mL，加入15 g琼脂，充分搅拌均匀后，分装于三角瓶中，121 ℃、0.1 MPa条件下灭菌25 min。

试验组：将最佳条件下提取的绿原酸溶液（得率约为3.5 mg·g-1）旋转蒸发至恒重后，用纯水完全溶解，定容至10 mL（溶液A：绿原酸质量浓度为0.003 5 mg·L-1）。将15 g燕麦加水煮烂，用4层纱布过滤于烧杯中补水至475 mL，加入称量准确的7.5 g琼脂，充分搅拌均匀后，分装于三角瓶中（溶液B），121 ℃、0.1 MPa 条件下灭菌25 min。分别取1.0、2.5、5.0 mL A液与B液混匀至100 mL，制成带药平板，此时换算得到培养基中绿原酸质量浓度分别为35.0、87.5和175.0 mg·L-1。

1.2.6 绿原酸对烟草疫霉菌丝生长的影响 试验前，超净工作台进行紫外灯杀菌消毒，同时将工作服以及双手用75% 酒精消毒；试验中所用器具灭菌后置于超净工作台，整个试验过程在酒精火焰旁进行[15]。用打孔器在培养5～7 d 的等直径疫霉菌落边缘（生长状况基本一致）打取直径为5 mm 的圆形菌饼，再用接菌针挑至平板中间，用封口膜封好后将培养基倒置于26 ℃培养箱中恒温培养。待对照组长满后观察试验组菌丝的生长情况，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每个处理重复3次。

抑菌率=对照菌丝直径- 试验菌丝直径／对照菌丝直径（2）

1.2.7 菌丝染色 用无菌刮刀分别刮取1.2.5中对照组和试验组适量菌丝，在10%福尔马林溶液中浸泡固定1 h，用PBS缓冲液反复冲洗数次，滴加20 mg·L-1 的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液200 mL，置于暗处30 min，将带有菌落的液滴放在荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 绿原酸标准曲线

根据绿原酸标准曲线（图1），用最小二乘法拟合，得到回归方程：y=0.048 1x-0.002 2，R2=0.999 9。

2.2 各因素对烟草秸秆粗提物中绿原酸含量的影响

2.2.1 料液比对绿原酸含量的影响 由图2可知，随着料液比的增加，烟草秸秆粗提物中的绿原酸含量呈逐渐上升的趋势，在料液比为1∶25时绿原酸含量高达2.5 mg·g-1，相较于1∶10的提高了1倍多。这说明酚类物质的提取与料液比有关，料液比越大，溶剂对酚类的浸提越充分。但是增加料液比的同时也会导致生产成本增加，因此需选取最适宜的料液比。

2.2.2 提取温度对绿原酸含量的影响 由图3可知，烟秆粗提物中绿原酸含量随着提取温度的升高呈先增加后降低的趋势，提取温度为60 ℃时提取率达到最大，约为2.08 mg·g-1，相较于50和70 ℃处理分别提高了15.51%和30.71%。提取温度增加更有利于提高绿原酸的含量，因为高温使分子运动加快，传质扩散系数也急剧增加[16]，绿原酸大量从烟秆中浸出，使绿原酸含量急剧增加，由于绿原酸中含有酯键、不饱和双键和多元酚等不稳定结构，故当温度持续增加时，绿原酸反而会发生分解、氧化和异构化，导致绿原酸含量降低[17]。

2.2.3 提取时间对绿原酸含量的影响 由图4可知，在微波辅助提取作用下，随着提取时间的延长，烟草秸秆粗提物中绿原酸含量逐步增加，在100 min时达到最大。绿原酸含量在60～100 min內呈直线上升的趋势，而在100～120 min内随着时间增加逐渐下降。这可能是因为提取时间过长导致绿原酸氧化分解或水解[18]，因此高温下不宜提取过长时间，最佳提取时间为100 min，此时绿原酸含量为1.75 mg·g-1，相较82 和120 min 处理得率提高了17.83%和26.67%。

2.2.4 乙醇浓度对绿原酸含量的影响 由图5可知，绿原酸含量随乙醇体积分数增大而增大，乙醇体积分数为50% 时绿原酸含量达到最大值，为1.90 mg·g-1。溶剂增加更有利于绿原酸的析出，但乙醇用量持续增加时，绿原酸含量反而略有降低，这是由于过高的乙醇体积分数不仅会挥发，还可能使其他杂质的渗出率有所增加[19]，从而导致绿原酸纯度不高，降低绿原酸含量。

2.3 烟草秸秆中绿原酸提取工艺优化结果

2.3.1 Box-Behnken中心组合试验设计结果 在单因素试验基础上，对烟草秸秆绿原酸进行三因素三水平共17 组响应面分析设计，试验结果见表2。可以看出，不同因素水平条件下，绿原酸含量在1.45～2.65 mg·g-1 之间，其中料液比为1∶25（g·mL-1）时绿原酸含量均较高（2.49～2.65 mg·g-1），而1∶15 的处理均较低（1.45～1.58 mg·g-1），表明料液比对提取效果影响较大。

2.3.2 回归模型的建立及显著性分析 采用Design Expert8.0.6软件对响应面优化试验得到的数据进行多元回归拟合，获得烟草秸秆粗提物中绿原酸含量对三因素的二元多次回归模型。

Y=2.11+0.53A ? 0.024B+0.051C ? 0.003 4AB ?0.017AC?0.006 5BC? 0.15A2+0.034B2+0.10C2 （3）

对回归数学模型进行方差分析（表3），检验方程的有效性和各因子的偏回归系数。通过统计学分析可知，模型F 值为215.52，P 值<0.000 1，表明回归模型为极显著；方差的失拟项（0.736 2）>0.05，故失拟项不显著。模型R2为0.996 4，证明模型的选择对绿原酸含量的影响可信度较高，可以用于对绿原酸含量的分析与预测。由表3可知，各因素对试验结果的影响为A>C>B，即料液比对绿原酸含量影响最大，其次是提取温度，乙醇体积分数影响最小。此外，A2对绿原酸含量影响为极显著（P<0.001），C2为高度显著（P<0.01）。

2.3.3 响应面分析 使用Design Expert 8.0.6 软件得到响应面和等高线，如图6所示。响应面越陡峭，表明各因素之间的两两交互作用越显著，也表明该因素对响应值的影响越显著。料液比和提取温度，乙醇体积分数和料液比两两交互作用显著，表现在这两组交互的响应面坡度陡峭。

2.3.4 验证性试验 由软件Design Expert 8.0.6分析得出烟秆粗提物中绿原酸含量最高的条件为料液比1∶15，提取温度50.03 ℃，乙醇体积分数50%，此时绿原酸含量为3.48 mg·g-1。考虑实际操作，以提取温度为50 ℃，按照优化后的条件进行验证试验。结果（表4）表明，所得绿原酸含量均值为3.49 mg·g-1，与预测值3.48 mg·g-1 接近，说明该响应面得到的预测值准确可靠，回归方程能够较为准确地反映各因素对绿原酸含量的影响。

2.4 绿原酸对烟草疫霉菌的影响

CK、35和175 mg·L-1 CGA处理下的烟草疫霉菌长势如图7所示。可以看出，低水平时，烟秆绿原酸对烟草疫霉菌的生长几乎没有径向抑制，但菌落状态有明显的改变，菌落整体分布较为均匀，但菌丝密度显著降低，能明显看到中间菌饼，而对照组菌丝密集，几乎完全掩没中间菌饼，均匀完整的覆盖整个培养基。烟秆绿原酸质量浓度为175mg·L-1时，对烟草疫霉菌丝径向生长抑制效果显著，菌落直径明显减小，且菌丝稀疏，分布明显不均。烟秆绿原酸质量浓度为175 mg·L-1时对菌丝生长抑制率达到32%。因此，绿原酸质量浓度越高对烟草疫霉菌丝的抑制作用越显著。

此外，荧光染料PI是一种能对DNA染色的细胞核染色剂，不能透过活细胞膜，但能够与破损细胞膜内的DNA特异结合，形成红色荧光[20]。图8中普通光场下，对照组菌丝密集且饱满圆润，表面较为光滑，而在绿原酸的影响下，菌丝形态发生明显变化，不仅疏松细小、表面粗糙，甚至有部分凹陷。荧光下未经处理的菌丝仅有少许染色，试验组菌丝几乎全部变红，表明绿原酸处理后，菌丝细胞膜破损，绿原酸能够破坏烟草疫霉菌丝的细胞膜，使细胞死亡，从而达到抑菌效果。

3 讨论

烟秆综合利用新途径是当前的研究热点之一，鲜见提取其活性物质用于植物病害防治。绿原酸对葡萄、黄瓜、圣女果、草莓等多种果蔬具有良好的保鲜功能[2122]，此外，绿原酸在增强植物抗病性等方面也发挥着重要的作用。Jiao等[23]研究表明，绿原酸可通过水杨酸介导的信号通路诱导桃对扩展青霉（Penicillium expansum）的抗性。同样，Xue等[24]认为，绿原酸与内源性水杨酸具有很强的协同调控作用。为推进烟草多用途利用，实现资源最大化利用，本文以烟草秸秆为原料，使用微波辅助提取技术，结合响应面法优化研究了料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数对烟秆中粗提绿原酸含量的影响，获取最佳提取工艺条件：料液比1∶15（g·mL-1），提取温度50.03 ℃，乙醇体积分数50%，微波时间180 s，此时绿原酸含量为3.48 mg·g-1。进一步开展烟秆绿原酸体外抑菌试验，证实175 mg·L-1绿原酸对烟草疫霉菌菌丝有显著的抑制作用，抑菌率可达32%，且通过损害烟草疫霉菌细胞膜的完整性进而达到抑菌效果，这与凌天孝等[25]研究肉桂醛对烟草疫霉菌的抑制机理相一致。烟秆廉价易得，绿原酸提取工艺简单，烟草秸秆绿原酸有望发展成为一种新的天然植物源杀菌剂。

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（责任编辑：温小杰）