外泌体作为载体构建药物投递系统在骨科疾病中应用进展

杨培川，马剑雄，王 岩，董本超，李 岩，马信龙

在人类生存和繁殖过程中，骨的合成、再生和吸收过程保持着精确的动态平衡，这是一个通过细胞与细胞之间的合作，对骨的物质转移和交换进行微调的过程。研究发现，骨再生与修复不仅是通过细胞间的相互合作来实现，还可以通过细胞外囊泡包裹的外泌体介质来实现，这种介质可以携带和传递蛋白质、脂质和信使核糖核酸(mRNA)，它与其他组织紧密相连。大量研究报道显示外泌体广泛参与细胞以外组织的信息传递和交换，对不同骨细胞具有一定的修复和促进作用，进而调节骨组织的正常和病理状态。所以外泌体在骨科疾病的诊断和治疗中有很大的应用前景和研究价值。

1 外泌体概述

1983 年，外泌体被发现于绵羊的网织红细胞中，当时认为它们可以帮助细胞处理残留的毒素。然而，经过多年的探索，人们最终认识到，它们实际上是一种由细胞所产生的直径为40～100 nm 的囊泡[1-2]，具有两个凹形的圆盘形结构。外泌体内含多种生物分子，如脂质、蛋白质、脱氧核糖核酸（DNA）、mRNA 和微小核糖核酸（miRNA）等，它们能够在细胞间进行有效的交流，从而实现“信使”的功能，而这些生物分子也具有极高的稳定性，即使在受到体液中酶的影响时也能够保持原有的状态。由于其独特的囊泡形态以及天然的生物学起源，外泌体能够提供良好的稳定性、针对性以及靶向性，因此它们对细胞之间的相互联系发挥着极其重要的作用，而且它们天然的生物学起源也使得它们更加安全，避免了发生任何的免疫反应。外泌体起源于内吞途径，从多泡体（multivesicular body，MVB）中释放，MVB 包含通过外泌体与细胞膜融合产生的多个囊泡。外泌体的产生包括4 个步骤：出芽、内陷、MVB 形成和分泌。作为出芽的一种形式，细胞膜的内陷形成网格蛋白包被的小泡，网格蛋白小泡进入细胞质形成早期内体。蛋白质、脂质和核酸经过特异性分选和封装，形成多个管腔囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），这些囊泡是外泌体的前体。在晚期内吞作用后，多个ILVs 进一步发展为晚期内体（late endosome，LEs）。然后，一部分LEs 进入溶酶体途径，而其他LEs 与细胞膜融合，最终以外泌体的形式将多个囊泡结构释放到细胞外基质中[3]。目前已经提出了不同的机制来解释外泌体的形成，其中大多数外泌体通过转运所需的内泌体分选复合体（ESCRT） 发挥作用，ESCRT 被包裹在MVB 中的管腔内，小泡被输送到溶酶体中进行降解，或以细胞外小泡的形式直接分泌到细胞外环境中[4]。外泌体进入受体细胞的机制可能同时涉及多种途径，外泌体可以直接与质膜融合，也可以通过吞噬作用、微胞饮作用和脂筏、小窝蛋白或网格蛋白介导的内吞作用被吸收[5]。不同类型的外泌体可能包含充当其他细胞配体的蛋白质信号，并且这些受体-配体相互作用可以用于靶向外泌体递送。这种自然机制激发了外泌体表面蛋白的工程化，用于靶向药物递送。外泌体广泛存在于所有体液和组织中，包括血液、尿液、母乳、羊水、滑液、腹水、唾液和脂肪组织。近年来，随着技术的进步，药物载体的开发得到了巨大的进展，从类脂体到聚合物，多种药物载体得到广泛研究，但一般的纳米载体在体内循环容易受到肝脏、脾脏及其他器官的巨噬细胞地侵蚀，并且其稳定性较弱，针对性也较弱[6-7]。而外泌体就完美地避开了这些问题。

2 外泌体在骨科疾病中的研究与应用

2.1 骨关节炎与外泌体 骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种由于软骨、韧带、肌肉和其他构成关节的结构退化而导致关节破坏的疾病。由于人口老龄化，其对社会和经济的影响越来越大[8]。OA 表现为原发性[9]和继发性[10]。原发性关节炎发生在先前完整的关节中，没有任何刺激因素，而继发性关节炎是由潜在的诱发因素（如创伤）引起的。OA 的诊断主要基于病史和体格检查结果，有或没有放射学证据。虽然一些患者最初可能没有症状，但最常见的症状是疼痛。目前针对OA 的治疗采用多种方法，包括非药物治疗[11-13]，例如锻炼、节食以及物理疗法，这些医疗方法都能够有效地减轻患者的疼痛反应，并且能够改善患者的生活。在有严重功能障碍的终末期患者中，外科手术是一种非常普遍的医疗方法[14]，它能够帮助患者恢复健康，并且能够获得更好的疗效。这几种治疗方法的目标都是缓解症状和改善功能状态。目前，尚无可行的方案可以显著改善关节内稳定性，并有效减缓OA 的发展。随着组织工程领域的飞速发展，外泌体被应用于治疗OA 的潜力已得到证实。外泌体通过调节细胞间通讯参与许多生理和病理过程，在人类关节腔中可检测到外泌体，并观察到其随OA 进展而变化。一些关节细胞，包括软骨细胞、滑膜成纤维细胞、成骨细胞和腱细胞，可以产生和分泌影响靶细胞生物效应的外泌体。此外，来自干细胞的外泌体可以通过促进软骨修复、抑制滑膜炎和介导软骨下骨重塑来保护OA 关节免受损伤[15]。潘崇治[16]通过探究过表达lnc RNA malat-1 的骨髓间充质干细胞（BMSC）的外泌体对软骨细胞炎症和细胞外基质的影响，发现在OA 中，过表达lnc RNA malat-1 的BMSC 外泌体可促进软骨细胞增殖和迁移，抑制了细胞凋亡、炎症反应和细胞外基质的降解，延缓软骨细胞的退变，具有很好的保护作用。Li 等[17]将脂肪间充质干细胞（AMSC）衍生的细胞外囊泡（EVs）与壳寡糖（COS）结合，探究其在OA 软骨损伤中的功能和机制，通过构建体内和体外大鼠软骨损伤模型，系统地研究了包装到大鼠AMSC-EV 中的低分子COS 对软骨损伤的影响和相关机制，发现白细胞介素（IL）-1β 能显著抑制软骨细胞的活力和迁移，并增强细胞凋亡，而壳聚糖寡糖和胞外囊泡壳聚糖寡糖（EVs-COS/EVs-COS） 偶联物逆转了IL-1β 诱导的变化，这些发现为治疗基于软骨损伤的OA 和其他退行性关节疾病的药物开发提供了新的见解和策略。Liang等[18]利用携带软骨细胞的亲合肽（CAP）融合表达展示于外泌体膜蛋白（lamp2b）上表面作为靶向的基因工程化外泌体可实现靶向软骨细胞，与无靶向的天然外泌体相比，关节内注射的CAP 外泌体能长时间保留在关节腔中，减少体内扩散。CAP 外泌体还通过致密的软骨基质将miR-140 传递至深层软骨区域，抑制软骨降解蛋白酶，并抑制大鼠模型中的OA 恶化。作为一种重要的细胞间通讯介质，外泌体极大地促进了OA 的发生和进展，并已显示出用于治疗OA 的强大潜力。

2.2 骨肉瘤与外泌体 骨肉瘤（osteosarcoma，OS）又称成骨肉瘤，是一种恶性骨肿瘤，特点是肿瘤细胞可直接产生骨样组织[19]。OS 主要发生于20 岁下青少年及儿童。导致该疾病的原因比较多，主要由间质细胞发展而来。OS 主要的症状为发病部位的包块，进展期可以出现疼痛或疼痛加重。X 线检查时可发现骨肿瘤边界不清，骨小梁破坏，骨质线破坏[20]。近些年对于OS 治疗的效果较前已经有了显著提高，5 年生存率由70 年代的20%上升到现在的60%～80%，OS 的治疗进展主要集中在免疫治疗及光疗等领域，其他各方面治疗也更加精准、高效[21]。目前，OS 的治疗方法主要为手术、化疗[22]、放疗、免疫、光热及疼痛管理等[23-25]。外泌体是一种微小的脂质囊泡，它们能够促进细胞之间的信息传递，并且可以影OS 细胞的功能，因此在OS 的发展过程中具有重要的意义。吉光荣等[26]利用外泌体载药技术，将抗结核药物利福平装载入人源间充质干细胞外泌体中，通过实验发现其具有显著的抑制肿瘤生长增殖、迁移和侵袭的疗效，能够促进肿瘤的细胞凋亡和细胞周期停滞，尤其对OS 细胞具有明显的抑制生长作用。将其制备为治疗肿瘤药物后对于提高OS 患者的治疗效果，改善预后和提高生存率具有重要的意义。Wei 等[27]利用间充质干细胞（MSC）来源的外泌体作为纳米药物载体靶向治疗OS，数据表明，MSC 衍生的外泌体可用作出色的纳米载体，将化疗药物阿霉素（Dox）特异性有效地递送至OS，从而增强对OS 的毒性并降低心脏组织的毒性。研究结果进一步表明，外泌体的靶向能力机制可归因于MSC 衍生的外泌体通过SDF1-CXCR4 轴对OS细胞的趋化性。这项工作可能为OS 的治疗提供新靶向方法。Wang 等[28]也利用BMSC 使用活性负载方法，制备EM-Dox，表现出比游离阿霉素更有效的肿瘤抑制活性和更少的副作用。这种新型的生物纳米药物系统为开发新型OS 精准药物提供了一个很有前途的机会。

2.3 骨质疏松症与外泌体 骨质疏松症（osteoporosis，OP）是老年女性和男性的主要临床问题。几乎所有的骨头都会因OP 导致的骨脆性增加而骨折。这些骨折与较高的医疗费用、身体残疾、生活质量受损和死亡率增加有关。由于骨质疏松性骨折的发病率随着年龄的增长而增加，诊断和治疗OP 及其并发症的措施成为一个主要的公共卫生问题[29]。目前，OP 的防治以预防为主，如运动、补充钙和维生素D 等。近年来大量研究发现，不同来源外泌体通过自身或协同作用，在骨质疏松的领域扮演着重要角色。不同来源外泌体通过其内的miRNA，经成骨或破骨代谢通路，作用于靶细胞影响骨代谢，参与了抗骨质疏松治疗及疾病的微观解释[30]。崔永志[31]通过对多能干细胞来源的间充质干细胞产生的外泌体进行修饰，构建一种骨靶向性的工程化外泌体，靶向成骨细胞特异性递送小干扰RNA（siRNA）干扰Shn3 基因表达，研究表明Shn3 基因敲除后可促进骨量明显增加，骨形成速率明显加快，此实验构建的工程化外泌体，将siRNA 特异性递送到成骨细胞，具有促进成骨分化、抑制破骨细胞形成和促进H 型血管形成的多重功效，为骨质疏松的治疗提供了新的方略。赵保兵等[32]公开了一种血浆外泌体在制备治疗OP 药物中的应用。此发明通过尾静脉注射血浆外泌体，能够有效改善OP 小鼠的骨质流失、脂肪堆积和破骨细胞增多现象，实现抗骨质疏松症作用，并且效果优于脐带间充质干细胞外泌体。炎症性肠病会导致骨质疏松，Guo 等[33]沿用其团队前期确立的工具细胞系基因编辑策略，生成基于骨靶向外泌体载药纳米颗粒，促进BMSC成骨分化治疗溃疡性结肠炎模型中的骨并发症。成功实现慢性肠道炎症性疾病骨病促骨合成代谢疗法的临床前研究。

3 总结与展望

近年来，外泌体已成为一个有吸引力的药物输送系统。尽管外泌体可以被认为是一种理想的药物载体，其可以满足多种临床医学的需求，如高效、安全、可持续、可控、可扩展、可重复使用，但它的实际运用仍处于萌芽阶段，还存在一些挑战，比如，如何更好地控制药物的运输，以及如何更精准地控制药物的运输，这些都还没有得到充分的探索。经过大规模临床前试验，证实了利用外泌体进行靶向治疗是一种有效方法，因此，深入探索它们的体内传递机理和生产过程中的质量控制标准显得尤为必要。即便当前外泌体生物学技术尚未完善，但是，随着更多科学家和工程师们的努力，未来它们将会被普遍应用，给患者带来更好的治疗效果。