水产品中孔雀石绿、结晶紫药物残留检测方法的优化

田雪莲，杨堃，兰承兴，李树林，李雪林

（福泉市农业农村局，贵州 福泉 550500）

孔雀石绿（malachite green, MG）为绿色有金属光泽的晶体，易溶于水以及乙醇、甲醇和戊醇，水溶液呈蓝绿色，是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌和杀寄生虫的化学制剂[1]。结晶紫（crystal violet, CV）是一种带有金属光泽的深绿色结晶性粉末，易溶于水，具有较好的杀菌作用，其结构、性质与孔雀石绿相似[2]。由于二者抗菌效果好，价格便宜，曾被广泛使用于水产养殖。它们在鱼体内可分别代谢为隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，且残留时间长，具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，已被列为水产养殖的禁用药物[3]。因此，准确快速测定水产品中孔雀石绿、结晶紫，具有重要意义。

目前，水产品中孔雀石绿、结晶紫的常用测定方法，主要有液相色谱荧光法、液相色谱串联质谱法和胶体金免疫层析法等[4]。《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》（GB/T 20361—2006）[5]由于前处理时间长，需多次萃取，多次离心，操作方法烦琐，有机溶剂用量大。现从提取、浓缩等方面，对该国标中水产品残留检测的前处理过程进行了优化，以此提升水产品中孔雀石绿、结晶紫的回收率与检测灵敏度。

1 材料与方法

1.1 材料

供试鱼购自农贸市场，经检测，不含孔雀石绿、结晶紫类药物。

1.2 试剂与仪器

孔雀石绿、结晶紫标准溶液由农业农村部环境保护科研监测所提供，质量浓度为100 mg/L；酸性氧化铝固相萃取柱（500 mg, 3 mL），PRS 固相萃取柱（500 mg, 3 mL）；乙腈为色谱纯，二氯甲烷、酸性氧化铝、二甘醇、无水乙酸铵、冰乙酸、氨水、对-甲苯磺酸、乙酸胺、硼氢化钾、盐酸羟胺均为分析纯；试验用水为去离子水。分别配制0.05 mol/L对-甲苯磺酸溶液（称取0.95 g 对-甲苯磺酸，用水稀释至100 mL）、0.1 mol/L 乙酸胺缓冲溶液（称取1.71 g 无水乙酸胺，溶解于1 000 mL 水中，氨水调pH 值至10）、0.125 mol/L 乙酸胺缓冲溶液（称取9.64 g 无水乙酸胺，溶解于1 000 mL 水中，冰乙酸调pH 值至4.5）。

Agilent 1220 液相色谱仪（配荧光检测器，美国安捷伦公司）；Scout SE 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；XW-80A 涡旋震荡混合器（上海精科实业有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TGL 16 M 离心机（长沙迈佳森仪器设备有限公司）；0.45 μm 滤膜。

1.3 色谱条件

C18（250 mm×4.6 mm）色谱柱；流动相：乙腈+乙酸胺缓冲溶液（0.125 mol/L，pH 值4.5）=80+20（V∶V）；流量：1.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量20 μL；荧光检测器激发波长265 nm，发射波长360 nm。

1.4 提取、净化与浓缩

按照文献[5]中前处理过程操作。

1.5 水产品中孔雀石绿、结晶紫药物残留的检测

取鱼肉样品5.00 g，按照60 μg/kg 的添加量，添加2 种标准品，按照添加不同体积硼氢化钾溶液、二氯甲烷溶液浓缩至1~2 mL，测定回收率与精密度试验，每个样品平行测定3 次，计算样品的加标回收率。

2 结果与讨论

2.1 不同体积硼氢化钾对回收率的影响

硼氢化钾作为强还原剂，能够把样品中残留的孔雀石绿或结晶紫，还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿或结晶紫。以硼氢化钾3，4 和5 mL进行平行试验，结果见表1。按照文献[5]，在加标质量比为60 μg/kg 条件下，孔雀石绿、结晶紫回收率分别为83.67%和71.33%；当硼氢化钾体积为4 mL 时，孔雀石绿、结晶紫回收率分别为91.33%和76.50%；当硼氢化钾体积为5 mL 时，孔雀石绿、结晶紫回收率分别为90.83%和76.00%。表明硼氢化钾体积为4 mL，回收效果最佳，孔雀石绿、结晶紫回收率分别提升7.66%和5.17%。

表1 不同体积硼氢化钾对孔雀石绿、结晶紫回收率的影响

2.2 不同体积二氯甲烷体积对回收率的影响

不同体积二氯甲烷对孔雀石绿、结晶紫回收率的影响见表2。采用25 和30 mL 二氯甲烷能提高孔雀石绿、结晶紫的回收率，当二氯甲烷体积为25 mL时，孔雀石绿、结晶紫回收率分别为93.00%和73.17%，且二氯甲烷不会发生倒向。因此，二氯甲烷体积为25 mL，回收效果最佳。

表2 不同体积二氯甲烷对孔雀石绿、结晶紫回收率的影响

2.3 不同旋转蒸发最终体积对回收率的影响

不同旋转蒸发最终体积对回收率的影响见表3。由表3 可见，旋转蒸发最终体积约为1 mL时，回收率最低，孔雀石绿、结晶紫分别为70.83%和64.33%；而浓缩至近干，以瓶底湿润为准，孔雀石绿、结晶紫回收率最高，分别为91.00%和76.17%。因此在试验中，旋转蒸发最终体积浓缩应该近干，以此提升孔雀石绿、结晶紫回收率。

表3 旋转蒸发最终体积对回收率的影响

3 结论

以文献[5]为蓝本，对鱼肉中的孔雀石绿、结晶紫药物残留检测方法进行优化及确认，发现强还原剂硼氢化钾的体积为4 mL、萃取剂二氯甲烷为25 mL、样品浓缩至近干时孔雀石绿、结晶紫回收率均较高。优化后的方法具有结果准确性高、稳定性好等优点，适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测。