饲粮中益生菌的添加对绿壳蛋鸡种公鸡睾丸发育及抗氧化功能的影响

李 丹，姜雨汝，张志鹏，杜 伟，许恒勇，张 姚，朱 庆，王 彦

（四川农业大学动物科技学院/农业农村部畜禽生物组学重点实验室，成都 611130）

抗生素被认为是医学上不可或缺的药物之一[1]，然而在现代畜牧生产中，抗生素的使用甚至滥用使得耐药细菌的数量不断增加，其所带来的负面效益日益突出。为此，越来越多的国家和地区开始禁止将抗生素作为畜禽生长的促进剂[2]，这就使益生菌、微生物制剂等绿色健康的抗生素替代物成为了养殖业的研究热点。

益生菌是一类有利于人、动物和植物生长的微生物的总称，包括细菌和真菌。当给予宿主足够数量的益生菌时，它能给宿主带来多种健康益处[3-4]。大量研究表明，益生菌作为饲料添加剂，对促进动物生长及改善养殖环境具有重要作用[5-9]。同时，它还可以改善动物肠道健康，增加肠道菌群的稳定性，抑制病原体的定植，从而降低发病率[10-13]。近年来，在家禽上，越来越多的研究也表明益生菌能提高家禽的生长性能，改善胃肠道的健康，增强其对致病菌的免疫反应等[14-15]。如A. Rehman 等[16]研究发现，在罗斯肉鸡中添加益生菌和益生元可以提高肉仔鸡的生长性能，同时还能提高传染性法氏囊病的抗体效应。Chen C.等[17]则发现饲粮中混合益生菌的添加能有效降低鸡白痢的死亡率，可调节肠道菌群平衡，防止鸡感染后发生白痢。此外，Yan F.等[18]报道称饲粮中益生菌的添加不仅改变了产蛋鸡盲肠微生物群组成，同时还降低了产蛋鸡无壳产蛋率，提高了骨矿化水平。

综上可以看出，目前关于家禽生产中益生菌的研究主要集中在肠道菌群、生长性能和免疫性能等方面，鲜少有对公鸡繁殖性能的研究。随着现代蛋鸡养殖的发展，种公鸡高品质的精液品质是保证种蛋受精率的重要前提基础，也是直接影响母鸡繁殖性能的关键因素。因此，种公鸡繁殖性能的优良就显得格外重要。基于此，本试验以绿壳蛋鸡种公鸡为研究对象，探究日粮中添加益生菌对绿壳蛋鸡种公鸡精液品质、血液指标和抗氧化性能的影响，以期客观评估其在绿壳蛋鸡种公鸡生产中的应用效果，从而为提高种公鸡的繁殖性能提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物及分组处理

本试验采用单因子试验设计，选取四川农业大学家禽育种场中体重相近且健康的绿壳蛋鸡种公鸡90只，随机分为2组，每组3个重复，每个重复15只鸡。对照组饲喂正常基础饲料和饮水；试验组除正常饮水外，则在基础饲粮中按1 g/kg 直接添加复合益生菌[复合益生菌购于山东苏柯汉生物工程股份有限公司，以芽孢杆菌（≥1×109CFU/g）、乳酸菌（≥2×107CFU/g）和酵母菌（≥1×107CFU/g）为主]。种公鸡30 日龄时，试验组的日粮中就开始添加益生菌，直至34周龄。饲养期间的基础日粮主要为玉米-豆粕（营养水平详见表1）。所有种公鸡采用3层梯式笼养方式，每笼饲养1只鸡。在试验期间，种公鸡自由饮水，自由采食。舍内温度、湿度、光照以及免疫程序均依照四川农业大学家禽育种场《绿壳蛋鸡种公鸡的管理手册》进行。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

1.2 睾丸样品采集与制备

在饲养的第34周，随机从试验组和对照组中各选取3 只种公鸡进行禁食、禁水处理，12 h 后，称量试验组和对照组中种公鸡的体重，颈部放血处死，随后采集公鸡两侧睾丸。将左侧睾丸用PBS 清洗后，放入4%多聚甲醛中固定（每48 h 换一次固定液），用于后续切片制作，而右侧睾丸则被放入液氮中冻存，用于后续RNA的提取和定量检测。

1.3 组织样品的制备与观察

将前期固定好的睾丸组织用清水冲洗后，采用常规脱水、透明、石蜡包埋和苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色的方法，将切片制备成5 µm厚度，放置于光学显微镜下观察。

1.4 精液品质测定

在第34 周时，采用背腹部按摩法采集精液（每个重复随机选取8 只鸡），将采集好的精液置于37 ℃水浴锅中保温，随后立刻按世界卫生组织（WHO）提供的精液质量测定方法[19]进行精液品质的检测。

1.5 血液指标测定

在240 日龄时，分别对每组鸡用翅静脉采血法采集血液2 mL，置于无抗凝剂的抗凝管中，随后2 000 r/min、4 ℃离心20 min，离心后吸取500 µL 血清置于新的EP管中备用。参照ELISA试剂盒（江苏宝莱酶免生物科技有限公司）的使用说明，利用Varioskan LUX 酶标仪测定种公鸡血清中的激素和抗氧化指标，包括睾酮（T）、雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）、促黄体激素（LH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（T-SOD）和总抗氧化能力（T-AOC）。

1.6 睾丸组织中抗氧化和凋亡相关基因表达水平的测定

1.6.1 引物设计与合成

根据GenBank 公布的鸡Caspase-3、Caspase-9、Bax、CyclinD1等基因序列信息，利用Primer 6.0软件设计特异引物（序列信息见表2）。试验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，所有引物均委托上海生物工程技术服务有限公司合成，为冻干品，使用时溶解于RNase Free ddH2O，稀释后引物浓度为50 pmol/µL，分装保存于-20 ℃冰箱备用。

1.6.2 荧光定量PCR

将40 mg 睾丸组织放于液氮中进行研磨，待其成为粉状后采用RNAiso plus 试剂提取睾丸组织中的总RNA。为除去RNA 中的DNA，采用Prime-ScriptTMRT reagent Kit 反转录试剂盒按其操作说明在含有2 µL 5× gDNA EraserBuffer，1 µL gDNA Eraser，6 µL RNase-Free ddH2O和1 µL RNA的体系中 通 过T100TMThermal Cycler PCR 仪，按42 ℃2 min、12 ℃保存的程序进行。接着，在含有1 µL PrimerScriptRTEnzyme Mix I，1 µL RT Primer Mix，4 µL 5× Primer Buffer 2（for Real time）和4 µL RNase-Free ddH2O 的反应体系中，通过37 ℃ 15 min、85 ℃5 s 的反应程序进行RNA 反转录，反转录形成的cDNA置于-20 ℃保存备用。

在含有1 µL 引物（10 µmol/L），1 µL cDNA，5 µL SYBR Green PCR Master Mix 和3 µL dd H2O 的反应体系中检测睾丸组织中各基因的表达情况。反应在CFX96TMReal-time PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）上进行，其反应条件为：98 ℃ 2 min；98 ℃ 2 s，X℃15 s（具体退火温度见表2），72 ℃ 10 s，共39 个循环。所有样品均进行3个技术重复。

表2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-PCR

1.7 数据分析

实时荧光定量结果利用CFX Manager系统进行查看，并利用2-△△Ct的方法计算基因的相对表达情况；所有数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，通过Duncan 法进行多重比较；利用Graphpad Prism 8 软件进行图表绘制。当P＜0.05 或P＜0.01时，则表示差异显著或极显著。

2 结果与分析

2.1 种公鸡精液品质的比较

对试验组和对照组绿壳蛋鸡种公鸡的精液品质进行比较，结果发现添加益生菌后种公鸡精子活力提高了5.6%，精子活率提高了9.5%，但两组间差异不显著（P＞0.05）。同时，益生菌降低了种公鸡精子畸形率（21.4%）、精液量（8%）以及pH 值（1.5%），但差异不显著（P＞0.05）（表3）。

表3 公鸡精液品质测定Table 3 Determination of semen quality in cocks

2.2 种公鸡睾丸组织结构的变化

为确定益生菌对种公鸡睾丸组织的影响，我们对其进行了HE 染色。HE 结果表明益生菌添加前后种公鸡睾丸组织的被膜都是完整的，且实质内生精小管管腔大小不一，呈圆形或卵圆形，管壁由基膜和复层上皮组成；薄层基膜紧贴上皮，上皮较厚，可见精原细胞、精母细胞和精子细胞、精子和支持细胞等，各类细胞形态结构较为正常（图1A 和图1C）。对比图1B 和图1D 发现，试验组中种公鸡生精小管内精子比对照组略多，且生精小管之间间质组织内可见血管；未见其他明显病理变化。

图1 睾丸组织HE染色结果（200×）Figure 1 HE staining results of testicular tissue （200×）

2.3 种公鸡血清生殖激素含量

如表4所示，与对照组相比，饲料中添加益生菌后，种公鸡血清中睾酮（T）和雌二醇（E2）的含量都极显著增加，分别提高了18.4%和13.7%（P＜0.01），而促卵泡素（FSH）却略有降低，但两组间差异不显著（P＞0.05）。同时，试验组种公鸡的促黄体激素（LH）含量比对照组提高了3.29%，但差异不显著（P＞0.05）。

表4 种公鸡血清中生殖激素的含量Table 4 Content of reproductive hormones in serum of male breeders

2.4 种公鸡血清抗氧化酶活性比较

由表5可知，添加益生菌后，种公鸡血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（TSOD）活性都极显著高于对照组（P＜0.01），分别高了14.6%和16.7%。此外，益生菌的添加显著提高了种公鸡血清中总抗氧化能力（T-AOC），这比对照组提高了30.2% (P＜0.05)。

表5 种公鸡血清中抗氧化酶活性测定结果Table 5 Determination of antioxidant enzyme activity in serum of male breeders

2.5 种公鸡睾丸组织中凋亡、增殖和抗氧化基因的表达水平

为了进一步探究益生菌的添加对睾丸发育的影响，我们通过RT-qPCR法检测了对照组和益生菌组种公鸡睾丸组织中凋亡基因和抗氧化基因的表达情况。由图2可知，与对照组相比，虽然益生菌组种公鸡睾丸组织内的促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的表达量均下降，且Bax的表达量增加，但两组间的差异都不显著（P＞0.05）。相反，添加益生菌后公鸡睾丸组织中细胞增殖和周期相关基因CDK2的表达量极显著提高（P＜0.001），且PCNA和CyclinD1的表达量也均有增加，但两组间差异不显著（P＞0.05）。此外，我们又检测了种公鸡睾丸中抗氧化基因的表达情况。由图3可知，添加益生菌后，种公鸡睾丸组织中抗氧化基因GPX2、GPX3、GPX4、GPX7、GST和GSR的表达量均显著或极显著高于对照组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），GPX1和SOD的表达量也均有增加，但两组间差异不显著（P＞0.05）。

图2 种公鸡睾丸组织中凋亡基因的表达情况Figure 2 Expression of apoptotic genes in testes of male breeders

图3 种公鸡睾丸组织中抗氧化基因的表达情况Figure 3 Expression of antioxidant genes in testes of male breeders

3 讨论

3.1 益生菌对绿壳蛋鸡种公鸡精液品质和生殖激素的影响

影响种公鸡精液品质的因素众多，主要包括种公鸡老龄化、饲料中营养缺乏和饲养管理中的应激因素等[20]，而种公鸡的精液质量又会直接影响种蛋的受精率、孵化率等生产指标[21]。因此，提高种公鸡精子质量是提高生产指标的关键。

前期，有研究学者发现益生菌的添加可以提高家禽精子量、产蛋量、蛋品质和孵化率，推测其原因，可能是益生菌使家禽体内产生了大量具有抗氧化和DNA 保护特性的裂解酶及代谢产物[22]。与此同时，G. Passini 等[23]研究也发现，精子的发生及精液品质与类固醇激素水平是密切相关的。本试验结果表明，饲粮中添加益生菌可提高绿壳蛋鸡种公鸡的精液品质。同时，试验组种公鸡血清中的T、E2和LH含量均有提高，而FSH略有下降，推测其原因可能与益生菌的添加浓度有关，但具体的原因还有待进一步研究。

睾丸是公鸡提供精子的主要场所，良好的睾丸条件对生殖能力至关重要[24]。有研究表明，35周龄前公鸡睾丸发育良好，睾丸内有良好的血管分布，而35周龄后，睾丸发育程度就会显著下降[25]。本试验采集240日龄（34.3周龄）种公鸡睾丸，从HE染色可以发现，睾丸内各类细胞形态结构较为正常，生精小管之间间质组织内有明显的血管分布，生精小管内精子分布较密集，且试验组高于对照组。由此可见，在种公鸡饲粮中添加益生菌可以改善睾丸发育情况。

3.2 益生菌对绿壳蛋鸡种公鸡生精细胞凋亡的影响

有研究发现[26]，精子发生过程中生精细胞会出现自发性和诱导性的凋亡，最终生成精子量的多少与生精细胞凋亡程度直接相关。本试验通过荧光定量PCR 测定了公鸡睾丸组织生精细胞的凋亡基因、增殖和周期相关基因的表达情况，结果发现，与对照组相比，促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9在试验组种公鸡睾丸组织中的表达量均降低，而细胞增殖和周期相关基因CDK2、CyclinD1和PCNA的表达量均增加。这一结果充分说明益生菌可以通过降低种公鸡睾丸组织中生精细胞的凋亡，促进其增殖进而来提高公鸡的精子量。

3.3 益生菌对绿壳蛋鸡种公鸡抗氧化能力的影响

当生物体受应激、外界污染和放射等影响时，机体内会产生大量自由基，进而损伤蛋白质或核酸等大分子物质，从而损害机体健康。为了保护机体免受损伤，机体中T-AOC、GSH-Px 和T-SOD 等抗氧化酶会自发消除过氧化氢、超氧自由基等活性氧来终止自由基链式反应，进而增强机体的抗氧化能力[27]。因此，提高雄性动物的抗氧化性能，保护其睾丸结构和功能对改善后期种公鸡的精液品质十分重要。例如，2018 年，齐晓龙等[28]研究发现在日粮中添加2%的亚麻油可显著增强种公鸡机体抗氧化防疫能力。2019年，他们又发现日粮中添加硒可显著提高种公鸡血浆抗氧化酶活性和精子活力[29]。同样，饲料中添加左旋肉碱（LC）可显著增加公鸡的精子活力、存活率、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性[30]。近年来，关于益生菌对鸡繁殖性能的研究更多是在母鸡上，如饲粮中益生菌（地衣芽孢杆菌）的添加可调节蛋鸡生殖激素分泌，从而提高蛋鸡产蛋性能和蛋品质[31]。而关于益生菌对种公鸡抗氧化性影响的研究还较少，在Inatomi 和Otomaru 的研究中，他们发现日粮中添加含有芽孢杆菌的益生菌后，公鸡睾丸中GSH-Px的表达量很高，进而改善了公鸡的氧化活性和精液质量[32]。和他们结果相同，我们也发现添加了益生菌后的公鸡血液中GSH-Px、T-SOD 和T-AOC 含量分别极显著或显著高于对照组，而且和对照组相比，益生菌组睾丸组织中抗氧化基因GPX2、GPX3、GPX4、GPX7、GST和GSR的表达量也显著或极显著增高，这进一步表明益生菌可以提高种公鸡的抗氧化能力。

4 结论

饲粮中益生菌的添加，可显著提高绿壳蛋鸡种公鸡血清中抗氧化酶活性，提高睾丸组织中抗氧化基因的表达，减少睾丸组织中生精细胞的凋亡，促进增殖，进而提高了种公鸡的精液品质，对提高种公鸡的繁殖能力有一定的改善作用。