结直肠癌组织中TMCO1、CALR 的表达水平与其根治术后预后转归的相关性分析

孙春龙，宋咏霞，王亿鹏

手术切除肿瘤是目前治疗结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的主要方式，但研究表明，行切除术与辅疗法治疗的患者， 仅有20%的患者能够痊愈，每年新诊断的CRC 患者中， 有20% ～25%的患者出现转移或转移性疾病［1-3］。因此，寻找可能监测评估CRC 根治术术后的预后转归因子仍是临床关注的热点。跨膜卷曲螺旋结构域蛋白1（TMCO1）是位于内质网上的新型钙离子通道蛋白， 钙网蛋白（Calreticulin，CALR）是内质网上高度进化的钙结合蛋白， 近年来有许多研究发现，TMCO1 和CALR 与肿瘤的增殖、转移有关［4-5］。故本研究拟通过对行根治术CRC 患者的TMCO1、CALR 的表达水平进行检测，分析其对患者术后预后转归的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017 年1 月～2018 年12 月于威海市文登区人民医院行根治术的182 例CRC 患者。其中男性101 例，女性81 例；年龄28 ～76 岁，平均（43.67 ± 13.89）岁；体质量指数（BMI）17.9 ～27.3 kg/m2；肿瘤大小3.1 ～8.5 cm；复发转移23 例，无复发转移159 例；病变位置结肠81 例，直肠101 例；糖尿病96 例，无糖尿病86 例；低分化37 例，中分化45 例，高分化100 例；TNM 临床Ⅰ期47 例，Ⅱ期74 例，Ⅲ期61 例；浸润深度T155 例，T273 例，T354例。纳入标准：（1）诊断标准符合《结直肠癌诊疗规范（2010 年版）》， 且经病理学检查确诊为CRC［6］；（2） 所有患者均接受根治性手术；（3） 过往未有放疗、化疗史。排除标准：（1）伴有其他急性、慢性肝肾功能障碍疾病或恶性肿瘤患者；（2） 心功能不全或患有先天性心脏病患者；（3）随访信息不全患者。

1.2 方法 收集所有患者基线资料包括年龄（岁）、性别、BMI（kg/m2）等一般资料以及肿瘤位置、直径（cm）、合并糖尿病、住院时间（d）、术中出血量（ml）、临床分期、浸润深度、分化程度和手术时长（h）等病理信息。

收集CRC 患者根治手术后切除的癌组织和癌旁正常组织标本，置于10%中性甲醛中固定，并用石蜡包埋，后将其切为厚度3 μm 的片，常规脱蜡、烘干水分，用pH 为8.0 的乙二胺四乙酸（EDTA）进行抗原修复，20 min 后滴加鼠抗人TMCO1、CALR单克隆抗体（试剂盒购自英国Abcam 公司）， 比例1：250，4℃条件下孵育过夜，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3 次， 滴加二抗工作液在室温下孵育60 min，再以PBS 洗涤3 次，用二氨基联苯胺显色，苏木素复染3 min，脱水，中性树胶封片。

采用BM1000 显微镜（南京江南永新光学有限公司，批准文号：苏械注准20172221144）在400 倍镜下对染色标本进行观察， 随机选择切片上10 个不同视野，评价每个视野下细胞的着色强度和阳性细胞占视野内细胞的百分比，计算总评分，取平均值。着色强度共0 ～3 级，分别代表无颜色、黄色、棕黄色和棕褐色。阳性细胞占视野内细胞百分比：X ＜1%， 计0 分；1%≤X ＜33%， 计1 分；33%≤X ＜66%，计2 分；66%≤X ＜100%，计3 分。总评分=阳性细胞视野占比×细胞着色强度，总评分≥2 定义为阳性，否则为阴性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件处理数据，计数资料采用（%）表示，行χ2检验；计量资料数据符合正态性，用（±s）表示，行t 检验；采用Logistic 回归分析CRC 患者根治术后复发转移的独立危险因素， 以Kaplan-Meier 生存曲线分析患者3年内的生存率，P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMCO1 和CALR 在癌组织和癌旁正常组织中的表达 CRC 患者癌旁正常组织TMCO1 和CALR的阳性表达率分别为13.74%、15.38%， 与癌组织（41.21%、43.41%）相比，差异具有统计学意义（P ＜0.05）；见表1。

表1 182 例CRC 患者癌组织及癌旁正常组织TMCO1 和CALR 表达水平比较［例（%）］

2.2 根治术后CRC 患者复发转移的因素分析

2.2.1 单因素分析 行根治术后3 年内，患者复发率为6.59%（12/182）， 转移率为6.04%（11/182），总体 发 生 率 为12.64%（23/182）；TMCO1、CALR 在 复发、转移患者中阳性表达率显著高于无复发、转移患者的阳性表达率，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

单因素分析结果显示，复发组、转移组中发生复发/转移患者的性别、 肿瘤位置、 合并糖尿病、BMI、住院时间、术中出血量、临床分期和手术时长与无复发/转移组患者比较， 差异无统计学意义（P＞0.05）；复发组患者的年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、TMCO1 和CALR 与无复发组比较， 差异有统计学意义（P ＜0.05）；转移组患者肿瘤分化程度、肿瘤直径、浸润深度、TMCO1 和CALR 与无转移组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 182 例食管癌根治术后患者复发转移的单因素分析［例（%），±s］

表2 182 例食管癌根治术后患者复发转移的单因素分析［例（%），±s］

注：BMI.体质量指数；TMCO1.跨膜卷曲螺旋结构域蛋白1；CALR.钙网蛋白

因素性别复发情况复发（n=12）无复发（n=170）t/χ2 值P 值 转移情况 t/χ2 值 P 值转移（n=11） 无转移（n=171）男女7（58.33）5（41.67）94（55.29）76（44.71）0.042 0.838 4（36.36） 97（56.73） 1.008 0.315 7（63.64） 74（43.27）肿瘤位置直肠结肠分化程度低分化中分化高分化TNM 临床分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期浸润深度T1 T2 T3合并糖尿病6（50.00）6（50.00）75（44.12）95（55.88）0.157 0.692 7（63.64） 74（43.27） 1.008 0.315 4（36.36） 97（56.73）7（58.33）3（25.00）2（16.67）30（17.65）42（24.71）98（57.65）11.746 0.001 8（72.73） 29（16.96） 14.624 ＜0.001 1（9.09） 44（25.73）2（18.18） 98（57.31）2（16.67）4（33.33）6（50.00）45（26.47）70（41.17）55（32.36）1.628 0.443 3（27.27） 44（25.73） 3.009 0.222 2（9.09） 72（29.24）6（45.45） 55（25.73）2（16.67）2（16.67）8（66.67）53（31.18）71（41.76）46（27.06）5.451 0.020 1（9.09） 54（31.58） 4.115 0.043 4（36.36） 69（40.35）6（54.55） 48（28.07）有无5（41.67）7（58.33）91（53.53）79（46.47）0.633 0.426 3（27.27） 93（54.39） 3.048 0.081 8（72.73） 78（45.64）TMCO1阳性阴性CALR阳性阴性年龄（岁）BMI（kg/m2）肿瘤直径（cm）住院时间（d）术中出血量（ml）手术时长（h）11（91.67）1（8.33）64（37.65）106（62.35）11.363 0.001 10（90.91） 65（38.01） 9.853 0.002 1（9.09） 106（61.99）10（83.33）2（16.67）58.16 ± 10.16 19.12 ± 2.30 4.71 ± 1.46 18.19 ± 5.97 121.50 ± 26.49 2.84 ± 1.47 69（40.59）101（59.41）64.49 ± 9.25 20.14 ± 3.15 5.24 ± 1.03 20.36 ± 4.82 118.37 ± 30.31 3.11 ± 1.23 8.337 2.277 1.100 1.672 1.483 0.348 0.726 0.004 10（90.91） 69（40.35） 8.795 0.003 1（9.09） 102（59.65）0.024 58.88 ± 9.37 64.30 ± 9.31 1.871 0.063 0.273 19.36 ± 1.80 20.10 ± 3.14 0.772 0.441 0.096 4.25 ± 0.83 5.24 ± 1.05 3.063 0.003 0.140 18.13 ± 5.84 20.31 ± 4.83 1.433 0.154 0.728 123.50 ± 28.61 118.35 ± 29.96 0.554 0.580 0.469 2.43 ± 1.18 3.13 ± 1.23 1.834 0.068

2.2.2 多因素分析 以CRC 患者术后有无复发、转移发生为因变量（复发/转移=1，无复发/转移=0），以单因素分析中具有统计学意义的因素为自变量进行logistic 多因素分析，结果显示，年龄、肿瘤低分化、TMCO1 和CALR 是CRC 患者根治术后复发的独立危险因素（P ＜0.05，OR ＞1）；肿瘤直径≥5cm、浸润深度T3、TMCO1 和CALR 是CRC 患者根治术后转移的独立危险因素（P ＜0.05，OR ＞1，表3、4）。

表3 182 例食管癌根治术后患者复发的logistic 多因素分析

2.3 Kaplan-Meier 生存曲线 行CRC 根治术3 年内，患者的死亡率为6.04%（11/182），以患者3 年内的生存结局为因变量， 绘制Kaplan-Meier 生存曲线，结果显示，TMCO1 阳性表达、阴性表达组的累积生存率分别为88.90%、97.30%（χ2=5.346，P=0.021），CALR 阳性表达、 阴性表达组的累积生存率分别为89.60%、97.10%（χ2=4.505，P=0.034），总体平均生存率为94.00%。

表4 182 例食管癌根治术后患者转移的logistic 多因素分析

3 讨论

CRC 的发病机制复杂，因病变部位在人体微生物最丰富的消化道中，一些特定细菌如具核梭杆菌容易在结直肠处富集，甚至存在于肝转移病灶中，产生基因毒性物质， 诱发基因突变致使CRC 发生［7］。该疾病特点使得根治术后患者易出现病情复发或转移，不利于患者预后，本研究182 例CRC 患者中，根治术后3 年内患者的复发转移发生率为12.64%，表明CRC 根治术患者的预后仍有待改善。

本研究结果显示，CRC 患者癌旁正常组织TMCO1 和CALR 的阳性表达率显著低于癌组织，表明TMCO1 和CALR 在CRC 患者中有异常表达现象，Logistic 因素分析显示，TMCO1 和CALR 均为根治术后患者复发、转移的独立危险因素，提示了该两种因子的阳性表达与术后的预后转归有密切关联，且其阳性表达率越高，患者复发转移的风险更高。TMCO1 形成的蛋白质通道对钙离子（Ca2+）具有高选择性， 对内质网中的Ca2+浓度的调控起到重要作用，当内质网中的Ca2+过载负荷时，钙信号紊乱，此时机体能激活TMCO1，促进钙的释放［5，8］。CALR是细胞内质网内具有高度保守性的一种多功能蛋白质，常在钙通道中表达并结合，主要参与蛋白质的折叠，维持体内Ca2+动态平衡［9］。因此，TMCO1 和CALR 两者对肿瘤细胞中的Ca2+调节均具有重要意义，而Ca2+在细胞中能影响细胞的信号传导，参与细胞的增殖、分化和凋亡，广泛存在于癌细胞的生长和转移中，当Ca2+浓度周期规律性上升时，Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通道被激活，该通路能介导癌细胞的增殖和迁移，催化CRC 的发生发展［10］。孙凯［11］的研究认为，TMCO1 高表达于肺腺癌及其转移癌细胞侵袭前端， 可通过Ca2+上调骨形态发生蛋白的表达，从而破坏细胞外基质，导致癌细胞迁移；齐顺利等［12］报道指出，TMCO1 可能通过刺激内质网的氧化应激作用促进结肠癌的发生， 且TMCO1 能降低CALR 的表达， 抑制结肠癌的侵袭和迁移过程。以上研究理论和报道均支持了本研究的结果。

此外，研究在患者行根治术后3 年内对患者进行随访生存情况， 结果显示，TMCO1、CALR 阳性表达组与阴性表达组的生存率具有明显差异， 表明TMCO1、CALR 的阳性表达能影响CRC 根治术患者的生存结局和生存质量。提示在临床工作中，可以根据CRC 患者癌组织TMCO1 和CALR 的阳性表达率，判断根治术术后的预后转归，但本研究的样本量有限且为单中心样本，TMCO1、CALR 两种因子作为预测指标在临床实际应用的准确率仍需要大量实践加以证实，有待进一步的修正。

综上所述，CRC 组织的TMCO1 和CALR 的阳性表达与其根治术后的预后转归有一定的关联，可作为判断患者预后的预测因子。