中医药干预葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达在糖尿病周围神经细胞凋亡的实验研究进展

代金玲，金 珠，李 雯

糖尿病周围神经病变是威胁糖尿病患者健康的重要隐患。在多民族成人2 型糖尿病的一项INTERPRET-DD 研究中，该病的总体患病率为26.71%［1］；据统计，2017 年世界范围内糖尿病患者大约有4.51 亿， 预计到2045 年被确诊患有糖尿病的人将增长到6.93 亿［2］。患者出现手足部麻木、痛觉过敏、或对称性烧灼感等与周围神经功能障碍相关的临床表现，甚至双足溃烂，最终可能导致截肢，这将大大降低患者的后期生存质量［3-4］。研究表明，在糖尿病大鼠神经细胞凋亡被抑制的状态下，其坐骨神经的形态学损伤会明显减轻，传导速度也会得到提高［5］。在应用中医、中药治疗糖尿病周围神经病变的相关研究中，葡萄糖调节蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78）被作为观测细胞凋亡的“指南针”。

GRP78 是重要的热休克蛋白70 伴侣蛋白， 主要存在于内质网膜上，帮助多肽链正确折叠，防止不正确折叠的蛋白聚集［6］。在人类9 号染色体上，4532 个核苷酸编码654 个氨基酸，组成GRP78。它是一种水溶性蛋白质，其中的小块疏水性片段对于识别未折叠蛋白质，并将这些蛋白定向降解或重新折叠至关重要［7］。参与蛋白质的合成、折叠和转运，以及减缓内质网应激过程中蛋白质折叠负荷、维持细胞正常生理功能，是GRP78 的两个主要功能［8］。这主要依靠位于氨基末端的ATP 结合结构域（ATP binding domain，ABD）和位于羧基末端的底物结合结构域（substrate binding domain，SBD）来完成［9］。现代研究表明，GRP78 纯合敲除的小鼠在胚胎发育第3.5 天表现出严重的增殖缺陷，GRP78 帮助蛋白正确合成，维持细胞内环境稳态，保障细胞正常生理功能［10］。中医药可以通过调节GRP78 的表达水平， 影响线粒体和内质网途径下游与凋亡相关因子的表达， 缓解糖尿病周围神经细胞凋亡（图1）［11］。

图1 GRP78 结构功能域示意图

1 中医药干预GRP78 表达调节线粒体途径诱导的糖尿病周围神经细胞凋亡

机体内大多数细胞凋亡皆是由线粒体控制，因此线粒体被喻为细胞凋亡的控制中心。高血糖造成线粒体膜电位降低或者消失，膜电位的下降意味着膜的膜通透性变强，这时膜内的细胞色素-C、Ca2+等促凋亡因子趁机流入到细胞质中，大量的促凋亡因子活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）；在Caspase-3 被激活后，它可以引起后续一系列与细胞凋亡相关的Caspase 级联反应，这些反应迫使DNA 断裂，最终致使细胞死亡［12-14］。GRP78 既可以稳定线粒体膜的通透性减少细胞凋亡，亦可以起到相反的作用增加细胞凋亡，通过中医药治疗手段调节GRP78 的表达水平， 可以有效改善糖尿病周围神经病变导致的细胞凋亡。

1.1 稳定线粒体膜的通透性减少细胞凋亡 GRP78 可以使线粒体膜的通透性恢复稳定， 抑制细胞色素-C 流入到细胞质中［15］。Caspase-3 活化的关键因子就是细胞色素-C，且在Caspase 级联反应导致的细胞凋亡中， 许多反应皆是通过激活Caspase-3 实现的，Caspase-3 是Caspase 级联反应发生的关键下游［16］。黄芪甲苷可以下调Caspase-3 的表达，保护线粒体结构和功能， 进而使背根神经节神经元细胞的死亡减少，缓解糖尿病大鼠周围神经的损伤［17］。已经有研究表明，晚期糖基化终末产物处理可以使大鼠雪旺细胞中GRP78 表达水平明显下降，Caspase-3 活性明显增强， 细胞凋亡指数升高，而糖络宁可以上调GRP78 的表达水平，降低Caspase-3 的表达，减轻坐骨神经病理损伤［18-20］。

1.2 提高线粒体膜的通透性增加细胞凋亡 另外，GRP78亦可以反其道而行之。有研究表明，GRP78 的表达水平的升高可以增加氧自由基产生，提高线粒体膜通透性，促进细胞色素-C、Ca2+释放以及capase-3 活化并导致细胞凋亡［21］。糖尿病大鼠氧自由基会和不饱和脂肪酸在线粒体膜上发生脂质过氧化反应，引起线粒体膜通透性增大，允许Ca2+通过线粒体膜释放至细胞浆，引起细胞内钙超载，激活Caspase 级联反应，导致DNA 断裂，引发细胞凋亡［22］。筋脉通能够显著降低糖尿病大鼠背根神经节GRP78 的表达， 减少氧自由基的生成，缓解坐骨神经损伤［23-24］。

综上，通过中医药手段干预GRP78 表达水平，可能成为阻断线粒体途径诱导Caspase 级联反应导致糖尿病周围神经细胞凋亡的新靶点。但因GRP78 对细胞凋亡具有双向调节作用，所以，在疾病发展的各个阶段，其最佳表达水平还有待进一探究。

2 中医药干预GRP78 表达调节内质网途径诱导的糖尿病周围神经细胞凋亡

当细胞暴露于高糖状态下时，蛋白将不能正确折叠并且顺利的从内质网中释放，随着这些不能正确折叠的蛋白在内质网腔中越积越多，将会导致内质网应激的发生。在应激状态下，内质网会通过未折叠蛋白反应帮助这些不能正确折叠的蛋白恢复正确折叠或者直接把它们降解，未折叠蛋白反应本质上是内质网维持自身稳态的一种手段［25］。但内质网自身恢复的能力是有限的，随着大量不正确折叠蛋白的长时间积累会导致未折叠蛋白反应失败， 并通过CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 （CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP） 通路以及Jun 氨基末端激酶 （Junami noterminal kinases，JNK）通路引起细胞死亡［26］。

当细胞处于内质网应激状态时，GRP78 与蛋白激酶RNA 样内质网激酶 （Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）解离导致CHOP 表达增加，过表达的CHOP 通过增加Caspase-3 的表达诱使细胞发生凋亡［27-28］。研究表明，抑制PERK、CHOP 的表达，降低Caspase-3 的活性，可以显著降低N2A 神经元细胞凋亡，对抗高葡萄糖诱导的神经毒性［29］。肌醇需要酶1（Inositol-requiring enzyme 1，IRE1）也是内质网膜上的感受器蛋白。在内质网应激条件下，GRP78 与IRE1 解离，IRE1 激活c-Jun 氨基末端激酶 （c-Junami no-terminal kinases，JNK），JNK 活化Caspase 级联反应，诱导细胞凋亡［30-31］。研究表明，JNK 信号通路参与乙醇醛诱导的背根神经节和ND7/23 神经元细胞的死亡， 并且JNK活性被抑制后，ND7/23 神经元细胞死亡得到显着改善［32］。

2.1 帮助蛋白质折叠减少细胞凋亡 GRP78 被认为是内质网应激的“信号灯”，在内质网应激条件下，GRP78 表达水平显著增加［33］。它以自身SBD 中富含赖氨酸的结构域为媒介，与内质网中非正确折叠或尚未折叠的蛋白质结合，通过ABP与ATP 结合， 从ATP 水解中获得能量帮助稳定蛋白质折叠并防止细胞凋亡［34-35］。草豆蔻有效成分生松素可以通过增加GRP78 蛋白的表达，促进未折叠蛋白折叠，减少内质网应激导致的脑神经元细胞凋亡，三甲基氧是一种化学伴侣，可以促进蛋白质正常折叠，抵消内质网应激，使糖尿病病程12 周大鼠保持正常的感觉神经传导速度［36-37］。

2.2 抑制感受器蛋白过度激活减少细胞凋亡 在内质网功能正常的情况下，GRP78 是以非活性形式与内质网上的无活性感受器蛋白结合， 所以当GRP78 更多的与感受器蛋白结合时，其表达水平应该是减少的，这与GRP78 为内质网应激的“信号灯”，GRP78 表达水平下降表明细胞内质网应激的程度得到缓解是一致的［9，38］。研究表明， 红花黄色素能降低GRP78 表达，使高糖状态下由于内质网应激引起的小鼠足细胞死亡得到缓解［39-40］。另外，在降低高糖状态下细胞GRP78表达水平缓解细胞凋亡实验中， 感受器蛋白PERK、IRE1 以及下游与细胞凋亡相关的物质CHOP、JNK、caspase 家族成员的表达水平也会随之下降［41-43］。因此认为通过降低GRP78表达水平可减少细胞凋亡， 实质上可能是通过促进GRP78与感受器蛋白结合，抑制感受器蛋白过度激活导致下游与细胞凋亡相关物质的产生。因此，通过中医药手段增强GRP78与感受器蛋白的结合能力可能是糖尿病周围神经病变治疗的新方向。

2.3 促进GRP78 与caspase-12 结合减少细胞凋亡caspase-12 是caspase 家族的第1 个内质网相关成员， 在内质网应激过程中，caspase-12 被特异性切割活化， 并进一步触发caspase-3 的活化，从而通过caspase 级联反应诱使细胞凋亡，当caspase-12 的活性被特异性抑制以后，细胞凋亡显著减少［44］。一项通过针刺保护糖尿病大鼠周围神经的研究结果显示，电针肺俞、脾俞、足三里等穴位减少caspase-12 在糖尿病大鼠坐骨神经中的表达， 亦可以减轻坐骨神经损伤［45］。有研究表明，GRP78 的异位表达可与caspase-7 和caspase-12 形成复合物，抑制caspase-12 介导的细胞死亡，糖络宁可以上调GRP78 的活性， 从而使在糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经中检测到的Caspase-12 的表达显著降低，减缓高糖状态下的细胞凋亡（图2）［46-47］。

图2 GRP78 调节糖尿病周围神经细胞凋亡示意图

3 总结与展望

祖国医学认为糖尿病周围神经病变是因消渴日久，气阴俱损，血脉瘀痹所致，属本虚标实之证。晋《针灸甲乙经》云：“卫气不行则为不仁，经曰：营卫不能相将，三焦无所仰，身体痹而不仁。”表明气虚不足以推动血液运行，三焦气化不利，水谷精微运行输布障碍，无以温养四肢百脉，导致肢体麻木不仁。近代医家对于糖尿病周围神经病变的治疗也多以益气养阴，和血化瘀为主［48-49］。由此可见，“虚”是该病发病的内在原因，虚则无以濡养全身，导致气血不足、血脉瘀阻、皮肉失养而痿痹，这与西医所讲的细胞凋亡不谋而合。通过中药、针刺、汤剂等方法多途径、多靶点调节GRP78 表达水平，抑制糖尿病状态下最为重要的caspase 级联反应导致的周围神经细胞凋亡，进而阻止内质网应激导致的细胞死亡，最终影响疾病的预后和转归。

糖尿病周围神经病变起病隐匿，不易发现，一旦出现症状或明显缺陷， 就无法逆转，10% ~ 18% 的患者在确诊为糖尿病时，就被发现有神经病变，这表明神经元损伤发生在疾病的早期阶段［50-51］。因此，早期诊断、及时干预是预防糖尿病神经病变发展的重要手段。GRP78 在大鼠血糖持续升高时，最先出现上升趋势，对糖尿病周围神经病变的预防和治疗皆有重要意义［52-54］。然而，纵观目前的研究，大部分文献仅提到通过中医药手段干预GRP78 表达水平对细胞凋亡有影响，并未说明其具体作用机制。因此，应进一步探索和研究其中的奥妙，以便更准确的调控GRP78 的表达，将中医药诊疗方法更好的应用于糖尿病周围神经病变的治疗。