银鼓鱼海豚链球菌的分离、鉴定及毒力基因检测

杨林狄，贾新蕾，黄增朝，吕静，梁华芳，黄郁葱*

(1.广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088；2.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东 湛江 524088；3.广东高等学校水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088)

银鼓鱼(Selenotocamultifasciata)，又称为多纹钱蝶鱼，隶属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)鲈形目(Perciformes)金钱鱼科(Scatophagidae)，广泛分布于澳大利亚、菲律宾和泰国等地的江河入海口，在中国东海南部至南海，以及北部湾区域亦有分布，该鱼栖息于海湾、河口、红树林及淡水河流和小溪的下游，目前，已开始在广东省、海南省和广西壮族自治区的网箱和池塘中大量养殖。银鼓鱼属于偏植食性的杂食性海水鱼类，具有耐高温和广盐的特性，其肉质嫩滑鲜美，深受广大消费者的喜爱，是一种兼具观赏和食用价值的重要经济鱼类。有关银鼓鱼的研究报道，主要涉及其胚胎发育、胚后发育观察[1-2]及对其完整线粒体基因组的测序[3]等方面，但对银鼓鱼的病害研究鲜见报道，仅见罗璋等[4]从天津某观赏鱼养殖场银鼓鱼中分离出一株海豚链球菌(Streptococcusiniae)。

2021年，北部湾地区银鼓鱼养殖场病害频发，造成大批量死亡。本研究中，对现场采集的患病银鼓鱼进行病原菌的分离鉴定，并全面开展了组织病理学、人工感染、毒力基因检测及药物敏感性等较为系统的研究，以期为后续北部湾地区银鼓鱼养殖中的病害防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

患病银鼓鱼于2021年分别采自广东省湛江市坡头区南三镇、廉江市和广西北海市的3个不同养殖场，从每个养殖场采集3尾，体长为(18±4)cm。回归感染试验用健康银鼓鱼体长为10～15 cm，购自湛江市某养殖场。

试剂：BHI液体培养基、BHI琼脂培养基、M-H血琼脂培养基和革兰氏染色试剂均购自青岛海博生物技术有限公司；血琼脂平板培养基购自广州环凯微生物有限公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；PCR所用试剂购自宝生物(大连)有限公司；细菌生化微量鉴定管、药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；海豚链球菌ATCC29178株购自美国ATCC菌种保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 组织病理学观察 取自然感染发病银鼓鱼的脑、心和肝脏等组织，迅速置于体积分数为10%的中性福尔马林中，固定24 h后，用乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明、石蜡包埋后进行切片(4～6 μm)，使用HE染色剂试剂盒进行染色，用中性树胶将切片封藏于玻片上，在显微镜下观察并对典型病变组织进行拍照。

1.2.2 病原菌的分离纯化 用体积分数为75%的乙醇棉球反复擦拭患病银鼓鱼体表后，在无菌条件下进行解剖，观察记录其内部器官的病症，取其脑、脾脏和肝脏组织，用无菌水冲洗、研磨，划线接种于BHI琼脂培养基，倒置于生化培养箱，28 ℃下培养24～48 h后，挑取优势单菌落在BHI琼脂培养基上反复划线纯化2～3次，获得纯化菌株。挑取纯化后的菌落于BHI液体培养基中扩大培养，并进行后续鉴定工作。

1.2.3 分离菌株的鉴定

1)菌落和菌体形态观察。用接种环挑取纯化后的单菌落，接种于血琼脂平板培养基上，倒置于生化培养箱，在28 ℃下培养24～48 h后，挑取单菌落制备菌液涂片，使用革兰氏染色试剂进行染色，观察其菌落形态及菌体形态并进行拍照。

2)生理生化鉴定。挑取纯化后的单菌落接种于细菌微量生化反应管中，倒置于生化培养箱，在28 ℃下培养24～48 h，以参考菌株ATCC29178作为阳性对照，根据《伯杰氏系统细菌学手册》[5]对菌株培养结果进行初步鉴定。

3)16S rRNA序列分析。利用细菌DNA提取试剂盒提取分离菌株的DNA，使用细菌16S rRNA通用引物27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′)和1492R(5′GGTTACCTTGTTA CGACTT 3′)对分离菌株的16S rRNA基因进行扩增。PCR体系(20 μL)：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Ex-Taq 10 μL，用ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃下预变性5 min；95 ℃下变性30 s，56 ℃下退火1.5 min，72 ℃下延伸1 min，共进行36个循环；最后在72 ℃下再延伸5 min。PCR产物经电泳检测验证后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将分离菌株的16S rRNA序列与GenBank数据库中已知核酸序列进行BLAST分析。采用MEGA 5.0软件，将分离株(BBW S1、BBW S2和BBW S3)与其他细菌的16S rRNA核苷酸序列一起构建系统发育树，节点的置信度检验采取Bootstrap分析(1 000个循环)。

1.2.4 人工回归感染试验 回归感染试验于广东海洋大学海洋生物研究基地室内养殖桶(体积为0.1 m3)中进行，水温控制在28 ℃，24 h持续充气，每天换水量为1/3，每日投喂两次商品配合饲料。将分离获得的菌株接种于BHI液体培养基，培养18～24 h后，用无菌PBS制成不同浓度的菌悬液。试验前随机取5尾实验室暂养14 d的健康银鼓鱼进行解剖，检测确认其无细菌、寄生虫和病毒感染后，将试验鱼随机分为6组，每组30尾。试验组银鼓鱼每尾腹腔注射0.2 mL浓度分别为1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/mL的菌悬液，对照组注射等量无菌PBS。接种后观察并记14 d内鱼的发病死亡情况，及时剖检濒死试验鱼，并再次对其致病菌进行分离鉴定。使用改进的寇氏法[6]计算半数致死量(LD50)。

1.2.5 海豚链球菌主要毒力基因的PCR检测 毒力基因pgmA和cfi的引物参照熊向英等[7]的方法设计合成，其余毒力基因scpI、simA、pdi、sagA和cpsD的引物参照Baums等[8]的方法设计合成。用PCR检测分离菌株携带scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7个主要毒力基因的情况，各毒力基因的引物序列、目的片段大小及退火温度见表1。PCR体系20 μL，同“1.2.3节”16S rRNA的PCR扩增。PCR反应程序：95 ℃下预变性5 min；95 ℃下变性30 s，按各基因的退火温度(表1)，退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共进行36个循环；最后在72 ℃下再延伸5 min。取5 μL PCR扩增产物，用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR扩增反应产物和长度。

1.2.6 药敏试验 采用K-B法[9]测定分离菌株对18种抗菌药物的敏感性。将分离菌株菌悬液浓度稀释至 1.0×108CFU/mL，均匀涂布于M-H血琼脂培养基，贴上药敏纸片，倒置于生化培养箱，在28 ℃下培养24 h后，使用游标卡尺测量抑菌圈大小，并按照产品说明书判定菌株的耐药性，试验设置3个重复并取其平均值。

2 结果与分析

2.1 患病银鼓鱼的临床症状

患病银鼓鱼离群独游，靠岸打转，体表特征为腹部肿胀，鳍基部充血发红(图1A)，眼球突出、充血(图1B)；剖检发现，肠道内有积水或黄色黏液，肝脏萎缩、发黄(图1C)。

A—鳍基部充血发红；B—眼球突出、充血；C—肠道积液、肝脏萎缩。A—red and congested fins；B—exophthalmos and hyperemia；C—intestinal effusion and liver atrophy.图1 患病银鼓鱼的临床症状Fig.1 Clinical syndrome of diseased Selenotoca multifasciata

2.2 组织病理学变化

对患病银鼓鱼进行组织病理观察发现，各组织器官均有不同程度的病变。患病的银鼓鱼脑膜增厚，伴随着毛细血管充血，大量淋巴细胞浸润(图2A)，且脑膜疏松水肿(图2B)；眼球的脉络膜血管细胞崩解、脱落(图2C)；心外膜增厚且伴随着炎性细胞浸润(图2D)；肝实质出现空泡变性，肝细胞有多灶性坏死(图2E)；脾实质组织多处液化坏死、疏松(图2F)，伴随着充血，炎性细胞浸润；肾小管萎缩、溶解 (图2G)；鳃基部细胞增生伴有充血(图2H)；肠道出现空泡样结构，肠黏膜破裂受损(图2I)。

2.3 病原菌分离鉴定

2.3.1 病原菌分离与形态学观察 从湛江市南三镇、廉江市和北海市3个不同养殖场的患病银鼓鱼组织中分别分离得到1株优势菌株，命名为BBW S1、BBW S2和BBW S3。3株分离菌株在BHI培养基中培养24 h后，均形成圆形、中央隆起、边缘光滑、直径约为0.7 mm的乳白色菌落，同时在血琼脂平板培养基上生长产生β溶血(透明溶血环)的菌落(图3A)，经革兰氏染色后镜检观察，均为紫色链状革兰氏阳性菌(图3B)。

A—血琼脂平板菌落形态；B—革兰氏染色后菌体的显微观察。A—colony morphology on blood agar；B—microscopic observation of bacterial strains after Gram staining.图3 分离菌株的菌落和菌体形态特征Fig.3 Colony and morphological characteristics of isolated strains

2.3.2 生理生化鉴定 从表2可见，3株分离菌株在10 ℃不生长，在37、45 ℃生长，溶血类型为β溶血，均可发酵麦芽糖、木糖、七叶苷、葡萄糖和蔗糖，不发酵甘露醇、山梨醇、乳糖、棉子糖和阿拉伯糖，V-P试验、触酶试验、赖氨酸、鸟氨酸、β-半乳糖苷酶和H2S检测呈阴性，精氨酸双水解酶呈阳性。其结果与阳性对照组ATCC29178基本一致，符合海豚链球菌的生化特性。

表2 病原菌部分生理生化特征Tab.2 Selected physiological and biochemical characteristics of pathogenic bacteria

2.3.3 16S rRNA序列分析 使用细菌16S rRNA通用引物对分离菌株BBW S1、BBW S2和BBW S3进行PCR扩增后，均获得预期大小约为1 500 bp的基因片段(图4)。将测序得到的序列使用BLAST进行比对，结果显示，均与海豚链球菌的同源性最高，一致性均达到99%以上。系统进化分析显示，分离菌株BBW S1、BBW S2和BBW S3与S.iniae亲缘关系最近(图5)。

综合分离菌株的形态特征及生理生化特性，并结合16S rRNA序列、BLAST比对及系统发育分析结果，判定3株分离菌株BBW S1、BBW S2、BBW S3均为S.iniae。

2.4 人工回归感染试验

从表3可见，3株分离菌株的LD50分别为3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL。试验鱼感染发病的症状与自然感染发病的银鼓鱼相似，从感染发病死亡的银鼓鱼体中再次分离细菌，均与原分离菌的形态特征一致，经16S rRNA鉴定仍为S.iniae。因此，确定3株分离菌株均为引起3个地区人工养殖银鼓鱼暴发性死亡的病原菌。

表3 银鼓鱼人工感染试验结果Tab.3 Results of artificial infection of Selenotoca multifasciata

2.5 海豚链球菌主要毒力基因的PCR检测

对3株海豚链球菌的scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7种毒力基因进行PCR检测，均扩增出了预期大小的片段(图6)，这表明3株海豚链球菌均含有以上7种主要的毒力基因。

M—DL2000 DNA marker；1-7—scpI，simA，pdi，sagA，cpsD，pgmA and cfi genes.图6 海豚链球菌主要毒力基因的PCR检测Fig.6 PCR detection of major virulence genes of Streptococcus iniae

2.6 药敏检测

采用纸片扩散法检测分离菌株对氟苯尼考和恩诺沙星等18种抗菌药物的敏感性，结果如表4所示，3株分离菌株均对阿莫西林、四环素、盐酸多西环素、恩诺沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、环丙沙星和多黏菌素B敏感，对头孢噻吩、青霉素G、红霉素等耐药，对氨苄西林、头孢他啶、庆大霉素、大观霉素、氟苯尼考、万古霉素和卡那霉素等有不同程度的敏感性。

表4 菌株的药物敏感性试验结果Tab.4 Drug susceptibility results of bacterial strains

3 讨论

3.1 病原菌的分离鉴定

从20世纪70年代开始，世界范围内就陆续有链球菌侵染鱼类导致死亡的案例报道，至今链球菌依旧是水产养殖动物患病的主要病原菌。海豚链球菌由Pier等[10]从亚马逊淡水海豚中首次分离得到，故被命名为海豚链球菌。Kitao等[11]于20世纪80年代首次报道海豚链球菌感染鱼类，并在患病的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、香鱼(Plecoglossusaltivelis)和尼罗罗非鱼(Oreochromisnilotica)中分离出海豚链球菌。迄今为止，海豚链球菌广泛流行于中国、美国、新加坡、日本、加拿大和澳大利亚等世界各地水域，可感染多种淡水、海水养殖品种及野生鱼类，导致鱼类大量死亡，对全球水产养殖业造成了巨大的经济损失。此外，海豚链球菌还能够威胁人类的健康与安全，目前，已有多例人感染海豚链球菌的报道。在中国已有海豚链球菌感染罗非鱼(O.niloticus)[12]、 卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)[12-13]和斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[14]等相关报道。本研究中，从3个养殖场的患病银鼓鱼中共分离得到3株优势菌BBW S1、BBW S2和BBW S3，通过菌株形态学、生理生化试验、16S rRNA序列分析和回归感染试验，鉴定其均为海豚链球菌，这与罗璋等[4]的研究结果一致，说明银鼓鱼是海豚链球菌的天然宿主。

3.2 海豚链球菌对银鼓鱼的致病性

鱼类感染海豚链球菌后的主要临床症状为眼球突出、全身性败血、心包炎及脑膜炎等[15]。脾脏和肾脏是鱼类重要的免疫器官，银鼓鱼感染海豚链球菌后，肾脏和脾脏严重损伤，进一步降低了银鼓鱼的防御能力，并引发多器官发生病变。本研究中，患病银鼓鱼出现脑膜增厚、疏松水肿等特征性病变，表明海豚链球菌能够突破银鼓鱼血脑屏障进入中枢神经系统，引起脑膜炎，其与鲟(Acipensersinensis)[16]、罗非鱼[17]感染海豚链球菌的病理特征相似。此外，本研究中发现，患病银鼓鱼的肝脏、鳃和肠道均有损伤，表明海豚链球菌通过血液循环到达各组织器官，导致多器官功能受损，最后致鱼器官衰竭死亡。

本研究中，人工回归感染试验显示，BBW S1、BBW S2和BBW S3的LD50分别为3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL，且受感染的银鼓鱼与自然发病银鼓鱼症状相似，说明3株海豚链球菌均对银鼓鱼具有较强的致病性。3株分离菌株间的LD50与杂交鲟源海豚链球菌的LD50(1.20×105CFU/mL)[18]及西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)源海豚链球菌的LD50(3.20×106CFU/mL)[19]值存在差异，说明海豚链球菌株的致病性与菌株来源、 宿主种类和大小等有关。

3.3 银鼓鱼海豚链球菌的毒力基因检测

海豚链球菌编码的大量毒力因子与其致病机制密切相关，在细菌黏附、定植、侵入和体内增殖及免疫逃逸等方面起着重要作用。研究表明，链球菌的致病力取决于细菌在宿主免疫细胞中的存活，以及感染、诱导细胞凋亡的能力[20]。simA基因编码的M蛋白是高度保守的毒力因子，在海豚链球菌的致病过程中起着重要作用，能够为海豚链球菌提供抗吞噬细胞的吞噬作用，有助于海豚链球菌对细胞的黏附和侵染[21]；sagA基因编码的溶血素S是目前已知最有效的细胞毒素之一[22]，能够破坏红细胞、血小板、中性粒细胞和淋巴细胞等细胞膜，以及线粒体、溶酶体等亚细胞器[23]；scpI基因编码的C5a肽酶能够水解中性粒细胞化学诱导物补体因子C5a，有助于海豚链球菌黏附宿主上皮细胞[21]；pdi基因编码的脱乙酰基酶能够使海豚链球菌对溶酶体产生耐受，增强海豚链球菌对宿主细胞的黏附和入侵能力[24]；cps编码的荚膜多糖能够调节和抑制吞噬细胞的吞噬，阻止宿主补体因子C3a的沉积，也能增强溶血素S的生成[25]；pgmA基因编码的葡萄糖磷酸变位酶对海豚链球菌的毒力至关重要，在维持正常的细胞壁形态、荚膜表达和抵抗先天免疫清除机制中发挥作用，参与细胞壁和荚膜生物合成，并能抵抗阳离子抗菌肽[26]；cfi基因编码的CAMP因子能使海豚链球菌以两种方式侵害宿主机体，第一种是协同其他能够分泌鞘磷脂酶的细菌溶解宿主细胞膜，第二种是结合免疫球蛋白Fc片段，拦截抗体向补体释放抗原[27]。海豚链球菌的致病力完全取决于其毒力因子，对菌株致病力的判断可以通过检测毒力因子加以辨别[28]。本研究中，对海豚链球菌7种主要毒力基因进行PCR检测，均能扩增出相应大小的条带，这与熊向英等[7]对卵形鲳鲹源海豚链球菌及白明焕等[29]对鲟源海豚链球菌的毒力基因检测结果高度相似，均含有上述毒力基因，表明3株海豚链球菌均为强毒株型。

3.4 海豚链球菌病的防治

鱼类链球菌病的发生是由环境、宿主和病原菌共同作用的结果，对其防治措施主要包括改善养殖水环境、免疫预防和药物治疗等方法。接种疫苗是预防链球菌病的有效方法，目前研发的海豚链球菌疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗。如王静波等[30]利用分离自患病杂交鲟的海豚链球菌制备灭活疫苗免疫杂交鲟，其相对保护率(RPS)高达92.8%；Locke等[21]将构建的海豚链球菌△simA突变菌株作为减毒疫苗，对条纹鲈(Moronesaxatilis)和斑马鱼(Daniorerio)均显示出较好的保护效果。目前，国外已有商品化的海豚链球菌疫苗。在养殖生产中，使用抗菌药物来预防和治疗细菌类疾病是最为简单和便捷的方法，药物敏感性试验对临床合理选择抗菌药物不仅具有重要的指导意义，而且能够避免因滥用抗生素而导致细菌的耐药性增强，减少多重耐药性菌株的产生。本研究中，自患病银鼓鱼分离的3株海豚链球菌均对恩诺沙星、盐酸多西环素等8种抗菌药物敏感，参考2020年6月农业农村部发布的最新《水产养殖用药明白纸》，银鼓鱼发病后，可采用水产用盐酸多西环素、恩诺沙星粉对银鼓鱼海豚链球菌病进行治疗。对于不同规格和养殖环境的患病银鼓鱼，其给药途径、剂量和间隔时间等尚需要进一步研究，以便制定合理方案，确保科学用药。此外，应鼓励开发绿色和安全的防治技术，如开发免疫调节剂、益生菌和中草药等绿色抗生素替代药物。

4 结论

1)从北部湾地区3个不同地域的养殖银鼓鱼中共分离出3株优势菌BBW S1、BBW S2和BBW S3，经形态学、生理生化和16S rRNA序列分析鉴定，均为海豚链球菌。3个菌株对银鼓鱼的半数致死量(LD50)分别为3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL，均具有较强致病性。

2)海豚链球菌可造成银鼓鱼脑、肝和脾等多脏器不同程度损伤，表现为变性、坏死及炎性细胞浸润等。

3)3株海豚链球菌均携带scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7种毒力基因，属于强毒株型。

4)根据药敏试验结果，在海豚链球菌引起银鼓鱼链球菌病的防治中，推荐交替使用水产用盐酸多西环素粉和恩诺沙星粉，并分别执行750度日和500度日的休药期。