基于网络药理学和实验探讨半夏-陈皮药对治疗卒中后抑郁的作用机制

徐春悦,冀旭艳,卫 治,李宝玲

卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是脑卒中常见的并发症之一[1]。有研究表明,约33.33%的中风幸存者受卒中后抑郁的影响,导致卒中后抑郁病人自杀率较高[2]。目前的治疗药物存在价格昂贵、副作用显著等不足。因此,迫切需要寻找经济有效的中医药方法治疗卒中后抑郁。本课题组前期临床研究及动物实验均证实,疏脑解郁汤治疗卒中后抑郁有较好的疗效[3-4]。由于中药复方多成分、多靶点的调节作用,因此,疏脑解郁汤治疗卒中后抑郁的作用机制尚未明确。疏脑解郁汤是李宝玲主任针对卒中后抑郁病人气郁、痰阻、血瘀病机,临床应用多年的经验方,半夏-陈皮是疏脑解郁汤中理气化痰的代表药对。本研究基于网络药理学结合实验充分挖掘疏脑解郁汤中半夏-陈皮药对在分子水平多成分、多靶点对卒中后抑郁的整体调节作用,为疏脑解郁汤的实验研究及临床合理应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 半夏、陈皮有效成分的收集与筛选 通过中医药系统药理学平台(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)分别检索半夏、陈皮的化合物成分,并根据药物代谢动力学进行筛选,初步筛选出活性化合物及其作用的蛋白质靶点。筛选标准为口服生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18。筛选结束后,统一在蛋白质数据库(UniProt,https：//www.uniprot.org)将蛋白质靶点信息进行标准化,并参照文献报道补充未预测到的蛋白质靶点信息。

1.2 卒中后抑郁相关靶点筛选 在人类基因数据库(GeneCards,https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库(http：//www.omim.org)中以“post-stroke depression”“post stroke depression”为关键词进行检索,在DrugBank数据库(https：//www.drugbank.ca)进行靶点补充。合并所有检索结果,删除重复值得到疾病靶点。

1.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建 将卒中后抑郁的靶点基因与半夏-陈皮成分靶点通过韦恩图获得半夏、陈皮主要活性成分作用于卒中后抑郁的预测靶点,利用Cytoscape 3.8.2软件构建“药物-成分-靶点”网络。

1.4 蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建与分析 将筛选获得的潜在作用靶点输入STRING平台(https：//string-db.org/),设置种属为“Homo Sapiens”(人类),相互作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9),其余设置为默认值,得到PPI网络,并通过Cytoscape 3.8.2中的MCODE插件对PPI网络进一步分析,得到潜在的蛋白质功能模块。

1.5 靶点富集分析 利用Metascape平台对半夏-陈皮治疗卒中后抑郁相关靶点进行信号通路分析,将有效成分与疾病的交集靶点录入Metascape平台,设置P<0.01,分析主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析,保存数据结果并借助SangerBox网站(http：//sangerbox.com/)进行可视化分析。

1.6 实验验证

1.6.1 实验动物 SD大鼠90只,雄性,无特定病原体(SPF)级,体质量(200±20)g,购自北京斯贝福技术有限公司,许可证号：SCXK(京)2019-0010。饲养环境：室温(22±3)℃,相对湿度45%～55%。

1.6.2 实验试剂与仪器 Bax购自武汉三鹰公司,批号：00039968;Bcl-2购自Abcam公司,批号：GR249198-76;GAPDH购自生工生物工程有限公司,批号：GC14AA0011;二抗(Goat Anti-rabbit)购自BiOS公司,批号：BJ08079044;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Solarbio公司,批号20200918;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自SEVEN公司,批号：20191101;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)快速凝胶配置试剂盒购自SEVEN公司,批号：20200914;Buffer购自SEVEN公司,批号：20191115;彩虹130广谱蛋白marker购自Solarbio公司,批号：917A021;脱脂奶粉购自Solarbio公司,批号：322R0515;等渗缓冲盐溶液(TBST)自制;电泳液自制;电转液自制。超敏电化学发光(ECL)检测试剂盒购自赛文SEVEN生物技术有限公司,批号：20200904。双向电泳系统(PROTEANi12 IEF Mini-PROTEAN Tetra PROTEAN 11 XL)购自美国Bio-Rad公司;半干式转印系统(TRans-Blot SemiDry PowerPac Universal)购自美国Bio-Rad公司;高性能成像分析仪(HD2)购自美国ProteinSimple公司。

1.6.3 模型制备 采用大脑中动脉栓塞(MCAO)+慢性不可预见温和应激(CUMS)进行卒中后抑郁模型构建,参照Zea longa线栓法[5]制作局灶性脑缺血后再灌注大鼠模型,术后1周,选取神经功能评分1～3分的大鼠,联合慢性不可预知性刺激建立卒中后抑郁模型。

1.6.4 分组及给药 卒中后抑郁大鼠模型建立成功后,随机分为正常组、卒中后抑郁组、盐酸帕罗西汀组、半夏-陈皮组。随机分组后,连续灌胃28 d,其中正常组、卒中后抑郁组给予生理盐水灌胃,给药剂量均为 10 mL/kg,每日1次。正常组、模型组灌胃生理盐水(10 mL/kg);盐酸帕罗西汀组灌胃盐酸帕罗西汀溶液,剂量 2 mg/kg。疏脑解郁汤中半夏10 g,陈皮10 g,半夏-陈皮组以大鼠与人等效剂量的2倍予以0.42 g/kg给药,每日1次,连续灌胃28 d。

1.6.5 观察指标 给药结束后,进行组织取材,采用蛋白免疫印迹法检测相关蛋白。各组大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉,下腔静脉采血后,于冰袋上进行断头取脑。取出脑组织后,冰上剥离海马组织,置于1.5 mL的EP管内,保存于-80 ℃冰箱。根据BCA蛋白定量浓度,以总蛋白50 μg进行上样。配制10%分离胶、5%浓缩胶。按照浓缩胶80 V、分离胶120 V的恒压条件电泳,待溴酚蓝到达胶底时停止电泳。按照25 V、30 min的条件进行半干转。使用含5%蛋白溶液封闭,4 ℃冰箱过夜。封闭过夜后将膜取出,用TBST洗涤3次,每次10 min。加入一抗4 ℃冰箱过夜,回收一抗,TBST洗涤3次,加入二抗孵育1.5 h。TBST洗涤3次,利用超敏化学发光试剂盒进行显色反应。最后,将PVDF膜置于高性能成像分析仪HD2系统进行曝光显影。

2 结 果

2.1 半夏-陈皮活性成分靶点的获取 初步提取半夏化学成分116种、陈皮化学成分63种,经药物代谢动力学筛选去重后获得靶点活性成分13种,其中半夏8种、陈皮5种,详见表1。半夏成分作用靶点83个、陈皮成分作用靶点61个,合并后删除重复值共得到靶点118个。

表1 半夏-陈皮主要活性成分

2.2 半夏-陈皮治疗卒中后抑郁核心靶点预测及筛选 通过GeneCards数据库获得疾病靶点5 423个。根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为卒中后抑郁的潜在靶点,通过GeneCards得到卒中后抑郁靶点Score最大值为70.2,最小值为0.24,两次中位数筛选为4.73,故设定Score>4.73的靶点为卒中后抑郁的潜在靶点。结合OMIM、DrugBank数据库补充相关靶点,合并后删除重复值,最终得到1 366个卒中后抑郁相关靶点。通过Venny(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny /index.html)在线工具,绘制半夏-陈皮与卒中后抑郁相关靶点的韦恩图,详见图1。

图1 半夏-陈皮与卒中后抑郁相关靶点韦恩图

2.3 “药物-活性成分-靶点”网络分析 网络中包含133个节点,其中药物节点2个、活性化合物节点13个、靶点节点118个,网络中圆形代表药物,菱形代表基因,六边形代表化合物活性成分,菱形代表靶基因。在网络中,每条边表示节点与节点之间的互作关系[6]。运用Cytoscape中的“Network analyze”进行度值分析,度值表示节点与其他节点的连接数目。根据活性化合物成分和靶点的中心度值大小进行筛选,排名居前5位的分别为MOL002670卡文定碱、MOL004328柚皮素、MOL000358 β-谷甾醇、MOL005828川陈皮素、MOL000449豆甾醇。在靶点中,排名居第1位的是雌激素受体1(ESR1),其余靶点包括凋亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)、雄激素受体(AR)、半胱氨酸天冬酶-3(Casp3)、半胱天冬蛋白酶-9(Casp9)、癌基因(JUN)、嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)、细胞周期蛋白A2(CCNA2),详见图2。

图2 药物-活性成分-靶点网络图

2.4 半夏-陈皮治疗卒中后抑郁靶点PPI网络的构建 将半夏、陈皮活性成分靶点与卒中后抑郁靶点取交集,进而将交集靶点提交至 STRING平台,得到PPI网络,详见图3。利用Cytoscape 3.8.2中的MCODE插件,通过分子复合物检测算法分析相互作用关系,得到模块(module)。module是PPI网络的潜在子网,连线密度较高,是密度较高的部分[6]。因此,module被认为是具有生物学意义的集合,有必要进一步识别内在module。详见图4。

图3 半夏-陈皮与卒中后抑郁靶点PPI网络图

图4 半夏-陈皮与卒中后抑郁靶点PPI网络中的module

2.5 富集分析 通过Metascape平台进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。设置P<0.01,主要的生物过程包括细胞对有机环状化合物的反应、膜电位的调控、正调控细胞死亡、离子运输的调节、对缺氧的反应、脂质代谢过程的调节、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路。详见图5。

图5 GO生物过程富集分析柱状图

对代谢通路进行富集分析,结果显示,主要的通路涉及癌症通路、血清素能突触、雌激素信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、神经活性配体-受体通路、内质网中的蛋白质加工、长寿调节途径、花生四烯酸代谢等。利用气泡图对富集基因数排名居前20位的通路进行可视化分析。纵轴表示通路名称,横轴表示富集因素百分比,气泡大小表示富集在该通路的基因数目。详见图6。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

2.6 蛋白免疫印迹法结果分析 蛋白免疫印迹法结果显示：相较于正常组,模型组Bax表达升高,Bcl-2表达减少;相较于模型组,盐酸帕罗西汀组、半夏-陈皮组Bax表达减少,Bcl-2表达升高,Bcl-2/Bax上调。详见图7。

图7 各组Bax、Bcl-2蛋白表达条带图 (A为正常组;B为模型组;C为盐酸帕罗西汀组;D为半夏-陈皮组)

3 讨 论

半夏、陈皮作用于卒中后抑郁的主要活性成分包括卡文定碱、柚皮素、β-谷甾醇、川陈皮素、豆甾醇。相关研究表明,柚皮素通过抑制氧化应激介质和核转录因子(NF)-κB/脑源性神经营养因子(BDNF)表达,改善反复低氧应激小鼠的抑郁行为[7]。Wang等[8]研究发现,川陈皮素通过AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)途径促进自噬,改善NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的炎症,调控抑郁症。

本研究KEGG分析涉及的通路主要包括癌症通路血清素能突触、雌激素信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、神经活性配体-受体通路等,结合前期研究结果[9],说明疏脑解郁汤调控卒中后抑郁的机制与cAMP/BDNF通路有关。本课题组前期免疫组化实验发现,与正常组比较,模型组BDNF表达降低,差异有统计学意义;与模型组比较,疏脑解郁汤组BDNF表达升高,差异有统计学意义[9]。疏脑解郁汤高剂量组可显著提高卒中后抑郁大鼠学习记忆能力,改善卒中后抑郁大鼠抑郁症状,对卒中后抑郁大鼠海马组织损伤具有保护作用[10]。cAMP/蛋白激酶A(PKA)/磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)/BDNF通路在学习记忆中发挥着重要的作用。突触后神经元钙离子浓度增加可激活腺苷酸环化酶,引起PKA活化[11-12]。cAMP可使丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)被运送到细胞核,之后CREB引起下游靶基因BDNF表达,从而影响原始突触的生长和新的突触形成,进而影响学习记忆[13-15]。GO生物过程富集分析显示半夏-陈皮具有正调控细胞凋亡的作用。相关研究表明,卒中后抑郁的发生发展与神经细胞凋亡密切相关,慢性应激通过促进神经元细胞凋亡,减少突触联系,最终导致抑郁样行为发生[16-18]。另有研究显示,橙皮苷通过上调抑凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白Bax表达,抑制氯化铝诱导的阿尔茨海默病大鼠神经细胞凋亡[19]。BDNF前体通过调控额前皮质凋亡信号影响脑卒中后抑郁大鼠行为[20]。

PPI网络中密度较高的module显示,Bax、Bcl-2是半夏、陈皮调控卒中后抑郁的重要靶点,因此,对Bax、Bcl-2进行实验证实显得尤为重要。中药复方具有多成分、多靶点的作用特点,充分挖掘疏脑解郁汤干预卒中后抑郁的作用机制,采用药对形式进行研究。疏脑解郁汤中除了半夏、陈皮药对,还有活血化瘀、宁心安神类药对,复方成分靶点网络更复杂,仍需进一步开展研究。

综上所述,半夏、陈皮药对作为疏脑解郁汤的主要理气化痰药对,可上调Bcl-2/Bcl-2比例,正调控细胞死亡进程,预测疏脑解郁汤调控卒中后抑郁的作用机制与改善神经细胞凋亡有关。