醛固酮受体拮抗剂螺内酯减轻肢体缺血再灌注致心肌损伤的信号传导机制

郭 悦,刘纯兴

肢体缺血再灌注是临床常见的病理损伤类型,肢体局部组织缺血后易发生再灌注损伤,并损伤其他远端器官[1]。其中心肌组织是缺血再灌注损伤的敏感器官,主要是在肢体再灌注损伤过程中释放大量的活性氧或炎性因子,并在心肌组织聚集大量中性粒细胞,导致心肌损伤[2]。醛固酮是由肾上腺皮质球状带合成并分泌的一种类固醇激素,具有调节水盐代谢及改善血压的功效,在心血管疾病的发生、发展中发挥着重要作用[3]。因此,醛固酮可能是心肌缺血再灌注损伤过程中的主要病理因素,采用醛固酮受体拮抗剂可有效拮抗醛固酮释放,并抑制炎性介质、黏附因子释放,减少心肌细胞凋亡,缓解心肌炎症状。螺内酯在肢体缺血再灌注致心肌损伤中的作用机制尚未明确。本研究通过建立肢体缺血再灌注模型,分析醛固酮受体拮抗剂螺内酯对肢体缺血再灌注致心肌损伤的作用,探讨其作用信号通路,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 30只健康Wistar雄性大鼠,由河北省实验动物中心提供,8月龄,体质量210～260 g;常规条件下正常饲养。螺内酯购自江苏宜兴前进制药厂;Nikon摄影生物光学显微镜(日本日立公司)、DF-205恒温干燥箱(北京西城区医疗器械二厂)。

1.2 制备动物模型 将30只健康Wistar雄性大鼠随机分为对照组(10只,正常饲养)、再灌注组(10只,建立肢体缺血再灌注大鼠模型)、螺内酯组(10只,建立模型前给予螺内酯)。利用橡皮圈环绕大鼠双后肢根部并进行结扎,阻断4 h,之后松解橡皮圈,再恢复血流灌注4 h。松解橡皮圈15 min前,腹腔注射20%乌拉坦(5 mL/kg)进行麻醉,于左侧颈外置管注射肝素后进行抗凝血。对照组双后肢用橡皮圈松弛环绕未阻断血流,4 h后取下橡皮圈,并恢复血流4 h。血流恢复后麻醉并处死大鼠。螺内酯组大鼠建立模型前,连续6 d进行螺内酯灌胃,每次20 mg/kg,6 d后成功建立动物模型并处死。

1.3 观察指标

1.3.1 心肌组织形态 麻醉处死大鼠后,留取心肌组织,石蜡包埋,组织切片,苏木精-伊红(HE)染色,显微光镜下观察心肌组织形态学改变。计算心肌细胞凋亡数,细胞核为棕褐色或为棕黄色,伴有凋亡细胞形态学。随机选择5个视野,每个视野极端阳性细胞占全部心肌细胞的百分比,计算凋亡百分比。

1.3.2 血清炎性因子 麻醉处死3组大鼠后留取血浆约6 mL及心肌组织,采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素(IL)-6、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达,试剂盒由武汉优尔生物科技股份公司提供。

1.3.3 血清心肌酶表达 采用全自动生化分析仪(日本HITACHI7200型)检测肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达。

1.3.4 心肌组织氧化应激指标 留取心肌组织,加入冷生理盐水制备为10%组织匀浆,离心10 min,以3 000 r/min,收集上清液,采用放射免疫法检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.5 相关基因表达 采用免疫组化法测定心肌组织HMGB1 mRNA表达、Toll样受体4(TLR4) mRNA表达。

2 结 果

2.1 3组心肌组织形态学变化及心肌细胞凋亡率比较 对照组心肌纤维排列整齐,细胞核均匀一致,心肌细胞纹理清楚;再灌注组心肌细胞肿胀、变性,细胞质红染,细胞核数量明显减少,心肌纤维坏死断裂,间隙增加,周围组织存在炎性细胞浸润、炎性物质渗出。螺内酯组心肌纤维排列较再灌注组整齐,间隙宽度缩小,心肌细胞呈轻微肿胀。对照组大鼠心肌细胞凋亡率为(5.28±1.05)%,再灌注组为(185.47±35.85)%,螺内酯组为(75.25±24.19)%,3组比较差异有统计学意义(F=131.575,P<0.001)。

2.2 3组大鼠血清心肌酶表达比较 再灌注组、螺内酯组血清cTnI、CK、CK-MB表达较对照组增加;螺内酯组血清cTnI、CK、CK-MB表达低于再灌注组,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠血清心肌酶表达比较(±s)

2.3 3组大鼠心肌组织氧化应激指标比较 再灌注组、螺内酯组心肌组织内MDA表达较对照组升高,SOD、GSH-PX含量较对照组降低;螺内酯组心肌组织内MDA表达低于再灌注组,SOD、GSH-PX含量高于再灌注组,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 3组大鼠心肌组织氧化应激反应指标比较(±s)

2.4 3组大鼠心肌与血浆IL-6、HMGB1表达比较 再灌注组、螺内酯组心肌与血浆IL-6、HMGB1表达均高于对照组;螺内酯组心肌与血浆IL-6、HMGB1表达均低于再灌注组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 3组大鼠心肌与血浆IL-6、HMGB1表达比较(±s)

2.5 3组大鼠心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达比较 再灌注组、螺内酯组心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达高于对照组;螺内酯组心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达低于再灌注组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 3组大鼠心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达比较(±s)

3 讨 论

肢体缺血再灌注损伤的病理过程复杂,通常再灌注损伤后释放大量氧自由基及炎性物质,导致大量细胞凋亡,造成除了肢体以外远隔器官损伤[4]。心肌组织是肢体缺血再灌注损伤后主要累及的敏感器官,可能是体内释放的大量氧自由基、炎性因子经血液循环到心肌组织,导致心肌组织损伤及心肌功能降低[5-6]。本研究建立肢体缺血再灌注损伤大鼠模型后心肌细胞肿胀、变性,细胞质红染,细胞核数量减少,心肌纤维坏死断裂,间隙增加,周围组织存在炎性细胞浸润、炎性物质渗出。说明肢体缺血再灌注损伤易诱发心肌损伤。螺内酯组心肌细胞凋亡率为(75.25±24.19)%,低于再灌注组的(185.47±35.85)%,差异有统计学意义(P<0.05)。因此,采用螺内酯提前给药处理,可减轻心肌损伤,减少心肌细胞凋亡数量。本研究结果也显示,螺内酯组血清cTnI、CK、CK-MB表达低于再灌注组(P<0.05)。结果证实螺内酯可减轻心肌损伤。

脂质过氧化是心肌细胞损伤的重要因子,其中MDA是细胞膜脂质过氧化的代谢终产物,其表达与脂质过氧化程度密切相关,可反映氧自由基水平[7];SOD、GSH-PX是机体防御自由基损伤的重要系统,是清除氧自由基表达、减轻组织器官损伤的重要因子[8]。本研究结果显示,再灌注组,螺内酯组心肌组织内MDA表达较对照组升高,SOD、GSH-PX含量较对照组降低;螺内酯组心肌组织内MDA表达低于再灌注组,SOD、GSH-PX含量高于再灌注组(P<0.05)。表明肢体缺血再灌注后处于强烈的氧化应激状态,采用螺内酯治疗可减轻机体氧化应激反应程度。由于肢体缺血再灌注后抗氧化酶含量及自由基清除酶系统活性降低,脂质过氧化系统激活,导致心肌组织处于高度的氧化应激状态[9-10]。炎症反应方面,再灌注组、螺内酯组心肌与血浆IL-6、HMGB1表达及心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达均高于对照组;螺内酯组心肌与血浆IL-6、HMGB1及心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达均低于再灌注组(P<0.05)。提示肢体缺血再灌注后处于强烈的炎症反应状态,导致心肌细胞损伤。

分析具体的作用机制：螺内酯通过结合心肌细胞膜上受体,激活磷脂酶C,以此升高细胞质内钙离子浓度,迅速激活蛋白激酶C,降低线粒体膜通透性,抑制氧化应激反应,减轻心肌细胞损伤[11-12];螺内酯抑制心肌细胞凋亡,延缓心肌细胞死亡,抑制心肌重构,以此延缓心肌损伤过程[13]。其作用信号传导主要是抑制HMGB1-TLR4信号通道,TLR4表达在心血管系统中升高,TLR4激活后可正向调控炎症信号通路,导致血管重构、内皮细胞损伤及心肌细胞凋亡,与心肌缺血再灌注损伤、心肌炎等多种疾病关系密切[14]。HMGB1是一种核蛋白,广泛存在于所有细胞内,是TLR4的重要配体,释放后与TLR4结合,促进体内固有免疫信号通路的活性,释放大量炎性因子,导致组织或器官损伤[15]。螺内酯通过下调HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达,抑制炎症反应,并拮抗醛固酮作用,减轻氧化应激反应,缓解心肌细胞损伤。

综上所述,肢体缺血再灌注后常导致心肌损伤,采用螺内酯治疗可减轻心肌损伤程度,可能是通过抑制氧化反应、抗炎症反应减轻心肌损伤程度,其作用信号传导通路主要是抑制HMGB1-TLR4信号通道及炎症反应,发挥缓解心肌损伤的作用,但具体机制需进一步研究。