响应面法优化欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培养基大量元素配方1)

蔡正禹 文书生 田如男

(南京林业大学,南京,210000)

欧洲冬青(IlexaquifoliumL.)别称枸骨叶冬青,是冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(IlexL.)常绿小乔木或灌木,原产于欧洲南部、中部及西北部,为北极第三纪孑遗物种。欧洲冬青具有良好的生态适应性,耐寒、病虫害少,其叶片革质光滑且四季常绿,冬季鲜红的果实掩映在苍翠的枝叶间,极为优美,在园林中可孤植、作绿篱或盆栽。Ilexaquifolium‘Ferox Argentea’是欧洲冬青的选育品种,是一种新优的彩色叶树种,其叶色浓绿且具光泽,边缘乳白色,叶片上表面及边缘具尖刺,扭曲,新生枝紫色,且该品种具有较强的耐寒能力和生态适应性,在园林绿化、盆栽以及切花生产中均具有很高的应用价值。目前,欧洲冬青多采用播种和扦插繁殖,播种繁殖周期长、萌发率低[1],扦插繁殖系数较低[2]。离体快繁技术能够克服上述传统繁殖方法的缺陷,故研究建立欧洲冬青离体快繁技术体系是其产业化推广的必然趋势。

冬青属离体快繁技术研究始于1994年[3],迄今国内外学者已初步建立巴拉圭冬青、大叶冬青、大别山冬青等十余个冬青属植物的离体快繁技术体系。然而,欧洲冬青的离体快繁技术研究仍存在诸多问题,Majada et al.[4]研究了植物生长调节剂(Plant Growth Regulator,缩写PGR)组合对其增殖和生长的影响,但增殖率低(1.35)、幼苗质量差。此外,本课题组前期筛选了欧洲冬青‘Ferox Argentea’的增殖培养基种类和PGR组合,发现WPM培养基效果最佳,最佳PGR组合为0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA,但增殖率仍不理想,仅为1.74。因此,如何提高增殖率是构建欧洲冬青离体快繁技术体系面临的首要问题,目前在冬青属植物的离体快繁技术研究中,提高增殖率的方法仅局限于培养基类型和PGR组合的探索[5-8]。目前,基础培养基矿物质成分对试管苗的增殖和生长具有显著影响[9],目前冬青属植物在增殖培养阶段主要使用WPM、MS、B5等模式培养基,但模式培养基的营养成分并不能精准满足其生长发育需要,因此,通过筛选培养基成分构建欧洲冬青的专用增殖培养基,是提高增殖率、解决其增殖难题的有效途径。

响应面试验法(RSM)是一种以数理统计为基础并结合中心组合设计、全因素设计、Box-Behnken设计及单因素设计等试验设计方式进行模型拟合并展开优化分析,从而得到最优研究方案的分析方式[10]。响应面试验法因其试验次数少、周期短、更直观、精确度高、能体现多种因素间相互作用关系等优势,已被广泛用于植物组织培养基优化研究,如增殖培养PGR组合优化[11-12]、增殖培养基大量元素配方筛选[13-14]等。目前,响应面试验法在冬青属植物的离体快繁技术研究中相关报道较少,本研究在课题组前期关于欧洲冬青离体快繁技术研究的基础上[15],以欧洲冬青‘Ferox Argentea’试管苗为材料,应用响应面最佳优化试验法对WPM培养基中5种大量元素无机盐配方进行优化,以期构建该品种专用的增殖培养基,为提高增殖率和建立该品种的增殖培养技术体系提供支撑,也为其他冬青属植物的离体快繁技术研究提供新思路。

1 材料与方法

切取‘Ferox Argentea’试管苗芽丛上茎长≥1.0 cm的健壮单芽(切除叶片)作为试验材料。

将切取好的单芽接种于增殖培养基,添加0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+蔗糖30.0 g/L+琼脂6.5 g/L,pH=5.8。以WPM为基础增殖培养基,并将其中5种大量元素无机盐作为自变量设计,质量浓度范围为原WPM培养基对应各无机盐质量浓度0.5到3.0倍。利用Design-Expert响应面最佳优化试验设计,获得32个试验组合,以原本WPM培养基大量元素无机盐成分作为对照(表1)。每个处理设3次重复,每次重复接种20株试管苗。增殖培养50 d后,统计试管苗的增殖率、株高、芽质量等级,增殖率=总芽数/总株数,株高为直尺测量试管苗根颈部到顶部之间的距离,芽质量等级为主观评价,分为3级,分别为:3(茎粗壮、叶片伸展)、2(茎健壮、叶片细长)、1(茎细弱、叶片细小)。将试验数据(表2)整理好导入Design-Expert 12.0中,拟合数据生成3个响应值对应的数学模型,通过数学模型运算获得优化配方后,对该最优处理进行验证试验,试验设3次重复,每次重复20株试管苗,50 d后统计平均增殖率、株高、芽质量等级。

试验材料置于南京林业大学风景园林江苏省重点实验室组培室培养,培养温度(25±1)℃,光照周期14 h/d,光照强度32.4 mol·m-2·s-1(荧光灯)。

表1 增殖培养基5种大量元素无机盐最优化试验水平

续(表1)

运用Design-Expert 12.0软件对试验结果进行分析。以增殖率、株高、芽质量等级和愈伤组织为目标函数建立模型,A、B、C、D和E分别代表K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O在增殖培养基中的质量浓度倍数(原WPM培养基对应各无机盐质量浓度倍数为1),对模型进行显著性检验、进行主效应分析与交互效应分析,推断各项生长指标的最显著影响因素。根据模型计算预测目标值对应各因素的置信区间,通过试验进行验证,获得优化配方。

2 结果与分析

按照表1进行33组试验,50 d后统计试验数据可得增殖率、株高和芽质量等级试验数据如表2。由表2试验数据可知,最佳增殖率处理为第7组,增殖率达到2.75;最佳株高处理为第22组,株高达到2.94 cm;最佳芽质量处理为第7组,芽质量等级达到2.89。综合来看,第7组为试验处理中最优组,增殖率、株高、芽质量等级达到2.75、2.92 cm、2.89,全面优于对照组(1.78、2.44 cm、1.78)。因此,可以确定培养基中无机盐质量浓度对欧洲冬青‘Ferox Argentea’存在显著影响。但仍未能通过试验确定适合欧洲冬青‘Ferox Argentea’的最佳无机盐质量浓度配方,也无法分析各无机盐质量浓度和交互作用对欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖阶段的影响,所以,进一步通过Design Expert 12.0将表2中试验数据进行数值分析并拟合模型,得到以下因变量的模型,通过模型来分析各无机盐质量浓度和交互作用对欧洲冬青‘FeroxArgentea’增殖阶段的影响。

2.1 增殖率模型构建与检验

通过Design Expert 12.0拟合试验数据,得出增殖率与增殖培养基5种大量元素无机盐的二次多项式:

增殖率=2.179 21+0.003 862 19A+0.052 353 3B+

0.056 418 7C+0.115 309D+0.082 601 9E+

0.062 171AB-0.138 168AC-0.008 145 25AD-

0.120 646AE-0.062 162 6BC+0.019 928 8BD-

0.068 467 7BE+0.009 442 58CD+0.030 232 6CE+

0.112 949DE-0.073 374 1A2-0.011 262 4B2-

0.292 519C2+0.233 499D2-0.418 04E2。

(1)

通过Design Expert 12.0对增殖率-增殖培养基5种大量元素无机盐模型进行显著性检验(F),结果显示平方项E2对模型影响极显著,线性项D、交互项AC和AE,平方项C2对模型影响显著,各因素显著性F值由大到小为F(NH4NO3)、F(Ca(NO3)2·4H2O)、F(KH2PO4)、F(MgSO4·7H2O)、F(K2SO4),大量元素无机盐对增殖率的影响程度由大到小为NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4(表3)。具体影响:(1)NH4NO3对增殖率具有显著影响,呈正线性相关(系数0.115 3);Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4对增殖率影响不显著(图1)。(2)K2SO4和KH2PO4的交互作用对增殖率具有显著影响,系数为-0.138 2,K2SO4和KH2PO4的质量浓度同时增大时,增殖率下降;K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用对增殖率具有显著影响,系数为-0.120 6,K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O的质量浓度同时增大时,增殖率下降(图1F、图1G)。(3)KH2PO4对增殖率影响不显著,但平方项C2对模型影响显著,系数为-0.292 5,随着KH2PO4质量浓度上升,增殖率先上升后下降(图1C);Ca(NO3)2·4H2O对增殖率影响不显著,但平方项E2对模型影响极显著,系数为-0.418 0,随着Ca(NO3)2·4H2O质量浓度上升,增殖率显著先上升后下降(图1E)。

表2 不同处理下增殖率、株高和芽质量等级

表3 增殖率-增殖培养基5种大量元素无机盐模型显著性

因为模型中其余交互作用F值较小,所以此处仅分析K2SO4-KH2PO4、K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O等4项交互作用,影响顺序由大到小为K2SO4-KH2PO4、K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O(表3)。由图2可知,K2SO4和KH2PO4、K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O浓度同时增大时,增殖率皆为先上升后下降。随着NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O浓度增大,增殖率增加。

2.2 株高模型构建与检验

通过Design Expert 12.0拟合试验数据,获得株高与增殖培养基5种大量元素无机盐的二次多项式:

株高=2.684 95+0.027 748 2A-0.038 126 1B+

0.066 424 4C+0.224 069D+0.161 806E+

0.012 344 3AB+0.039 522 5AC-0.105 483AD-

0.052 996AE+0.041 131 2BC+0.048 185 6BD-

0.062 998 3BE+0.009 050 38CD-0.159 046CE-

0.071 599 1DE+0.300 246A2-0.118 237B2-

0.274 574C2-0.100 789D2-0.186 869E2。

(2)

A.K2SO4-增殖率模型影响图;B.MgSO4·7H2O-增殖率模型影响图;C.KH2PO4-增殖率模型影响图;D.NH4NO3-增殖率模型影响图;E.Ca(NO3)2·4H2O-增殖率模型影响图;F.K2SO4和KH2PO4交互作用-增殖率模型影响图;G.K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O交互作用-增殖率模型影响图。图中实线为拟合线性模型,虚线表示误差区间,横坐标为对应单因素,取值范围0.5～3.0,纵坐标为响应值,取值范围1.0～3.0,二元影响图中,黑色线为左侧指定无机盐低质量浓度时拟合模型,红色线为高质量浓度时拟合模型。

A.K2SO4-KH2PO4二元交互图;B.K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图;C.MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图;D.NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图。x1轴、x2轴坐标为左侧对应无机盐的质量浓度倍数,取值范围0.5～3.0,Z轴为对应响应值变化,变化区间1～3.0。

表4 株高-增殖培养基5种大量元素无机盐模型显著性

通过Design Expert 12.0对株高-增殖培养基5种大量元素无机盐模型进行显著性检验,结果显示线性项D对模型影响极显著、线性项E和交互项CE,平方项A2对模型影响显著,各因素显著性F值由大到小为F(NH4NO3)、F(Ca(NO3)2·4H2O)、F(KH2PO4)、F(MgSO4·7H2O)、F(K2SO4),大量元素无机盐对株高的影响程度由大到小为NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4(表4),具体表现:(1)NH4NO3对株高具有极显著影响,呈正线性相关(系数为0.224 1);Ca(NO3)2·4H2O对株高具有显著影响,呈正线性相关(系数为0.161 8);KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4对株高影响不显著(图3)。(2)KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用对株高影响显著,系数为-0.159,随着KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O质量浓度增大,株高减小(图3F)。(3)K2SO4不显著,但平方项A2对模型影响显著,系数为0.027 7,表示K2SO4质量浓度增大时,株高先降低后上升(图3A)。

因为模型中其余交互作用F值较小,所以此处仅分析MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O、K2SO4-NH4NO3、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O等4项交互作用,影响顺序由大到小为KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O、K2SO4-NH4NO3、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O(表4)。

A.K2SO4-株高模型影响图;B.MgSO4·7H2O-株高模型影响图;C.KH2PO4-株高模型影响图;D.NH4NO3-株高模型影响图;E.Ca(NO3)2·4H2O-株高模型影响图;F.KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O交互作用-株高模型影响图。

由图4可知,MgSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用对株高影响较大,且两者质量浓度同时增大时,株高先增加后下降。K2SO4和NH4NO3、NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用对株高影响较小,K2SO4和NH4NO3质量浓度同时增大时,株高先下降后增加,随着NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O质量浓度增大,株高增加。

A.K2SO4-NH4NO3二元交互图;B.MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图;C.KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图;D.NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图。

表4 芽质量-增殖培养基5种大量元素无机盐模型显著性

2.3 芽质量模型构建与检验

通过Design Expert 12.0拟合试验数据,获得芽质量与增殖培养基5种大量元素无机盐的二次多项式:

芽质量=2.500 86+0.019 872 7A-0.008 862 82B+

0.126 868C+0.324 12D+0.259 86E-0.190 116AB+

0.046 257 5AC-0.178 353AD+0.060 190 3AE+

0.036 158 4BC+0.122 05BD+0.109 91BE+

0.118 596CD-0.175 896CE-0.078 692 5DE+

0.041 223 5A2-0.008 298 39B2-0.340 861C2-

0.132 026D2-0.362 125E2。

(3)

通过Design Expert 12.0对芽质量-增殖培养基5种大量元素无机盐模型进行显著性检验,结果显示线性项D、E对模型影响极显著,交互项AB、AD、CE和平方项C2、E2对模型影响显著,各因素显著性F值由大到小为F(NH4NO3)、F(Ca(NO3)2·4H2O)、F(KH2PO4)、F(K2SO4)、F(MgSO4·7H2O),大量元素无机盐对芽质量的影响程度由大到小为NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、K2SO4、MgSO4·7H2O(表5)。具体表现:(1)NH4NO3对芽质量具有极显著影响,呈正线性相关(系数为0.324 1);Ca(NO3)2·4H2O对芽质量具有极显著影响,E2系数为-0.362 1,说明Ca(NO3)2·4H2O质量浓度增大时,芽质量先上升后下降;KH2PO4、K2SO4、MgSO4·7H2O对芽质量影响不显著(图5)。(2)K2SO4和MgSO4·7H2O的交互作用、K2SO4和NH4NO3的交互作用和KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用都对芽质量影响显著,系数为-0.190 1、-0.178 4和-0.175 9,两种大量元素无机盐质量浓度同时增大时,芽质量均下降(图5F、图5G、图5H)。(3)平方项C2对模型影响显著,系数为-0.362 1,KH2PO4质量浓度增大时,试管苗的芽质量先上升后下降(图5C)。

A.K2SO4-芽质量模型影响图;B.MgSO4·7H2O-芽质量模型影响图;C.KH2PO4-芽质量模型影响图;D.NH4NO3-芽质量模型影响图;E.Ca(NO3)2·4H2O-芽质量模型影响图;F.K2SO4和MgSO4·7H2O4交互作用-芽质量模型影响图;G.K2SO4和NH4NO3交互作用-芽质量模型影响图;H.KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O交互作用-芽质量模型影响图。

因为模型中其余交互作用F值较小,所以此处仅分析K2SO4-MgSO4·7H2O、K2SO4-NH4NO3、KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O等3项交互作用,影响顺序由大到小为K2SO4-MgSO4·7H2O、K2SO4-NH4NO3、KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O(表5)。具体表现:(1)MgSO4·7H2O质量浓度倍数为0.5～1.8倍时,K2SO4质量浓度单独增大,芽质量上升;MgSO4·7H2O质量浓度倍数为1.8～3.0时,随着K2SO4质量浓度增大,芽质量下降。K2SO4质量浓度倍数为0.5～1.8时,随着MgSO4·7H2O质量浓度增大,芽质量上升;K2SO4质量浓度倍数为1.8～3.0时,随着MgSO4·7H2O质量浓度增大时,芽质量下降。K2SO4和MgSO4·7H2O质量浓度同时增大时,芽质量先上升后下降(图6A)。(2)K2SO4质量浓度倍数0.5～3.0之间,随着NH4NO3质量浓度增大时,芽质量上升并达到峰值。NH4NO3质量浓度倍数为0.5～1.9时,随着K2SO4质量浓度增大,芽质量上升;NH4NO3质量浓度倍数为1.9～3.0时,随着K2SO4质量浓度增大,芽质量下降。K2SO4和NH4NO3质量浓度同时增大时,芽质量先上升后下降(图6B)。(3)KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O质量浓度同时增大时,芽质量先上升后下降(图6C)。

2.4 大量元素配方优化及验证

本研究中对照组的增殖率、株高、芽质量等级分别为1.78、2.44 cm、1.78,根据对增殖阶段试管苗各生长指标需求,将预测模型算法中3项响应值增殖率、株高、芽质量等级的重要程度由大到小设定为增殖率、株高、芽质量,然后通过Design-Expert 12.0中上述(1)(2)(3)二次多项式模型综合预测得到欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖阶段大量元素无机盐最优配方质量浓度倍数为:K2SO4=0.50,MgSO4·7H2O=1.43,KH2PO4=2.13,NH4NO3=3.00,Ca(NO3)2·4H2O=2.30,其增殖率、株高、芽质量等级预测值分别为2.85、3.23 cm、2.89。对该最优配方进行验证试验,实际获得增殖率、株高、芽质量等级分别为2.91、3.14 cm、2.76,与预测值无显著差异,并显著优于对照组(1.79、2.45 cm、1.78)(图7)。

A.K2SO4-MgSO4·7H2O二元交互图;B.K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图;C.KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互图。

A.增殖培养前,欧洲冬青‘Ferox Argentea’的健壮试管苗;B.试验生长表现最差组试管苗(第8组);C.预测最优配方验证组试管苗;D.对照组试管苗(原WPM培养基)。

3 讨论

3.1 单因素对欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培养的影响

本研究中NH4NO3对增殖率、株高、芽质量等级影响显著或极显著,Ca(NO3)2·4H2O对株高、芽质量等级影响显著或极显著。K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4在0.5～3.0质量浓度倍数范围内对增殖率、株高、芽质量等级影响不显著。

在WPM培养基中,NH4NO3可提供具有生长调节作用的硝态氮和铵态氮[16-17],对试管苗的不定芽、叶片以及节间产生影响[18]。本研究发现,WPM基础培养基中的NH4NO3质量浓度无法满足欧洲冬青‘Ferox Argentea’试管苗的增殖和生长需求,提高WPM培养基中NH4NO3质量浓度倍数至1.59～3.00倍,试管苗的增殖率、株高、芽质量等级比对照组提升约35%～60%。目前,NH4NO3含量不足对试管苗增殖和生长的抑制作用已在诸多植物中报道,但是不同植物以及同种植物不同品种适宜的最佳质量浓度存在较大差异,例如梨(Pyrusspp)最佳NH4NO3质量浓度为1 416.00 mg·L-1、杏(PrunusarmeniacaL.)最佳NH4NO3质量浓度为700.00 mg·L-1、榛子(CorylusheterophyllaFisch.)最佳NH4NO3质量浓度为708.00 mg·L-1[19-21]。此外,过量的NH4NO3会抑制植物生长,例如过量的NH4NO3对榛子生长产生抑制作用,具体表现为增殖率降低和出现茎尖坏死[22]。本研究中0.5～3.0倍WPM培养基NH4NO3质量浓度区间内,未发现抑制作用,通过响应面优化试验,处理结果和响应面预测值均得出NH4NO3质量浓度倍数为3.0倍时,试管苗增殖效果最佳,这可能是因为WPM培养基配方中NH4NO3质量浓度远低于欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培养需求,所以在0.5～3.0倍质量浓度区间内,未能发现NH4NO3的抑制作用。

Ca(NO3)2·4H2O在WPM培养基中提供部分硝态氮源[23-24]和植物生长所需的钙离子,培养基中的钙离子与植物生长具有密切关联[25]。Akin et al.[26]在对榛子各品种进行DKW培养基离子响应面优化的研究中发现,Ca2+离子和品种基因型对增殖率影响最大,Ca(NO3)2·4H2O质量浓度为原DKW培养基的1.5倍时,榛子增殖效果最佳,而DKW培养基中Ca2+的质量浓度约为WPM的3倍[27],这意味着WPM培养基中的Ca(NO3)2·4H2O质量浓度提高到原有的4.5倍才能使榛子增殖效果达到最佳。王新等[28]对凤丹牡丹(PaeoniaostiiT.)增殖培养的研究中发现提高Ca(NO3)2·4H2O质量浓度至WPM培养基原质量浓度4倍时,单株增殖系数由2.36增至3.07。但试管苗吸收过量的Ca2+也可能导致茎尖坏死[29]、增殖率降低,本研究中Ca(NO3)2·4H2O质量浓度倍数达到2.30倍时,各项响应值达到最佳,超过2.302倍时,响应值开始下降,说明试管苗在Ca(NO3)2·4H2O高质量浓度时会受到过量Ca2+的抑制。

3.2 交互作用对欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培养的影响

4 结论

培养基中盐离子本身的质量浓度以及离子之间的交互作用对植物生长发育影响显著,然而,不同植物材料对离子交互效应的响应具有个体差异性,所以针对特定植物设计专用培养基可以有效解决一些植物的增殖困难技术问题[42-43]。本研究基于响应面优化法对WPM培养基的大量元素无机盐成分进行优化,构建了欧洲冬青‘Ferox Argentea’的专用增殖培养基,优化配方为K2SO4495.00 mg·L-1、NH4NO31 200.00 mg·L-1、MgSO4·7H2O 529.10 mg·L-1、KH2PO4362.27 mg·L-1与Ca(NO3)2·4H2O 1 279.92 mg·L-1,其对应WPM的大量元素无机盐质量浓度倍数分别为0.50、1.43、2.13、3.00和2.30倍。该优化条件下,试管苗的增殖生长表现(增殖率2.91,株高3.34 cm,芽质量等级2.76)显著优于对照组,其增殖率约为前人研究成果的1.5～2.0倍。本研究通过响应面法最优实验设计构建了高效的欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培养技术体系,研究结果不仅能为该品种种苗规模化生产提供技术支撑,还能为其他冬青属植物增殖培养问题的解决提供新思路。