CD146在视网膜血管内皮细胞中的功能和机制

林永 杨汝森 闫东升 陈晓燕 吕帆

病理性新生血管是许多致盲性眼病的共同特征之一。目前临床主要采用激光光凝术和玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子（anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF）治疗相关疾病[1]，其中常用的anti-VEGF药物包括贝伐单抗、雷尼珠单抗[2]。尽管anti-VEGF的使用能够有效缓解病情，但部分患者治疗无效[3]，以及治疗是否会对神经发育造成影响仍然存在争议[4]。因此，研究治疗视网膜新生血管的新靶点具有重大意义。

黑色素瘤细胞黏附分子又称细胞分化抗原146（Cluster of differentiation 146，CD146）属于免疫球蛋白超家族，是一种约为113 kDa的细胞表面糖蛋白，最早因在人原发性黑色素瘤中高表达而被发现。研究表明，CD146的表达异常还与其他肿瘤有关，如前列腺癌[5]、乳腺癌[6]等。CD146 基因位于人染色体第11号长臂，CD146蛋白结构由胞外区、跨膜区和胞质尾区组成，其中胞质尾区具有蛋白激酶的潜在识别位点，与蛋白激酶结合后可参与信号转导[7]。有研究表明CD146除了是细胞黏附分子，同时也作为血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的共受体，在许多生理和病理性血管生成过程中发挥重要作用[8]。但到目前为止，CD146对视网膜血管内皮细胞的调节作用及其机制尚未完全明了，故本研究旨在探索CD146 在视网膜血管内皮细胞中的作用和机制，为视网膜新生血管相关疾病的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验细胞

2021 年1—6 月C57BL/6J孕鼠6 只购于上海维通利华公司。实验动物的饲养遵循温州医科大学动物伦理委员会要求（批号：Wydw-2019-0316）。人视网膜微血管内皮细胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC）购于美国Angio-Proteomie公司。

1.2 实验试剂与仪器

胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、内皮细胞培养基（Endothelia cell medium,ECM）购于美国Sciencell 公司；0.05%胰酶、转染试剂（LipofectamineTM RNAi MAX Reagent）购于美国Invitrogen公司；体内转染试剂（Polyethylenimine，PEI）购于美国Polyplus transfection公司；小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）购于广州锐博生物公司；细胞活力分析试剂购于美国Promega公司；细胞增殖检测试剂盒Click-iT® EdU imaging kits购于美国Invitrogen公司；细胞周期检测试剂盒Cycle test plus购于美国BD公司；Matrigel基质胶购于BD公司；BCA试剂盒购于美国Thermo公司；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38（Phospho-p38 MAPK，P-p38）、Ras同源家族成员A（Ras homolog gene family member A，RHOA）、β-肌动蛋白（β-Actin）抗体购于美国Cell signal technology公司；CD146抗体购于美国Abcam公司；硝酸纤维素膜购于德国GE Healthcare公司。实时定量PCR仪购于美国ABI公司；流式细胞仪购于美国BD公司；SpectraMax M5酶标仪购于美国Molecular Devices公司；激光共聚焦显微镜购于日本蔡司公司；手术显微镜购于德国徕卡公司；动物氧仓、细胞氧仓和氧气监测器均购于Biospherix公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及细胞缺氧处理 HRMEC培养于含5% FBS、内皮细胞生长因子（Endothelial cell growth supplement，ECGS）、青霉素/链霉素的ECM培养液中，5% CO2、37 ℃培养，90%融合时用0.05%胰酶消化，1:4传代，培养至对数生长期进行后续实验。细胞置于细胞缺氧培养箱，1% O2、5% CO2、37 ℃培养，进行缺氧处理。

1.3.2 siRNA转染 将细胞接种于12 孔板中，待细胞融合50%～60%时，250 μl OPTI-MEM中加入1.5 μl LipofectamineTM RNAi MAX Reagent和5 μl siRNA，室温静置15 min后加入孔板中 。转染12 h后，更换培养基继续培养进行后续实验。为防止脱靶效应，设计2条siRNA链，siRNA的序列为：CD146-1：5'-CCA TCT CCT GGA ACG TCA A-3'；CD146-2：5'-GCA CCT CCA CAG AGA GAA A-3'。NC：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'。

1.3.3 细胞增殖相关实验 细胞活力测定：取96孔板，每孔接种3×103个细胞，siRNA转染培养48 h后，加入细胞活力检测试剂，37 ℃避光孵育2 h，酶标仪490 nm波长测量每孔的吸光度值（Optical density，OD）。细胞增殖实验：细胞转染48 h后用Click-iT®EdU imaging kits试剂对细胞进行免疫荧光染色，检测细胞的增殖情况。细胞周期实验：细胞转染48 h后用0.05%胰酶消化，弃上清，加入Cycle test plus试剂盒中的试剂染色，用细胞流式仪分析细胞周期。以上实验均重复3次。

1.3.4 细胞迁移相关实验 划痕实验：将细胞接种于12孔板，siRNA转染48 h后，用100 μl无菌枪头进行划痕并改用低浓度血清培养基继续培养24 h。显微镜下拍照分别记录0 h和24 h的划痕宽度，计算细胞迁移面积。Transwell实验：siRNA转染细胞48 h后消化并计数，每个transwell小室内接种2.5×104个细胞，24 h后固定、染色，显微镜下拍照记录迁移的细胞数。以上实验重复3次。

1.3.5 血管生成实验 96孔板内每孔加入Matrigel基质胶，置于37 ℃直到基质胶凝固。将siRNA转染后的细胞消化并计数。2×104个细胞每孔加入铺好胶的96孔板，37 ℃、5% CO2培养4～6 h，显微镜下观察血管形成情况，并拍照记录。以上实验重复3次。

1.3.6 OIR模型构建 氧诱导视网膜病变（Oxygen induced retinopathy，OIR）模型是视网膜新生血管相关研究的最常用动物模型，C57BL/6J小鼠出生后第7天（Postnatal 7，P7）连同母鼠一起放入75%±2%O2饲养仓饲养，每日更换母鼠，出生后第12 天（Postnatal 12，P12）放置到常氧环境（21% O2）中继续饲养，在出生后第17天（Postnatal 17，P17）小鼠视网膜新生血管数量达到峰值，取该时期小鼠进行进一步实验。

1.3.7 免疫磁珠法分离小鼠视网膜血管内皮细胞按照本实验室分离的方法[9]进行操作。

1.3.8 免疫荧光染色 OIR小鼠及其正常对照小鼠各4只饲养至P17，取眼球包埋、液氮速冻。冰冻切片机切片后进行固定、通透、封闭。CD146（1:100）和GS-ib4（1:100）4 ℃孵育过夜。荧光二抗室温避光孵育1 h（1:400），PBS清洗二抗，滴上含DAPI的荧光抗淬灭剂，封片。激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.3.9 玻璃体腔注射和视网膜铺片 取P13的OIR小鼠，用PEI配置siRNA后，在手术显微镜下右眼注射siCD146（100 μmol/L）2μl，左眼注射等量无意义小干扰RNA溶液作为对照。小鼠饲养至P17，取眼球，4%多聚甲醛室温固定1 h，体式显微镜下分离视网膜，甲醇通透。PBS清洗后，加入GS-ib4染色剂（1:100），4 ℃避光孵育过夜。PBS清洗后，铺片、封片、荧光显微镜下观察视网膜血管。注射siRNA序列如下：siCD146：5'-CCG AGT TCA TAT CCA GTC A -3'；NC：5'-GGC TCT AGA AAA GCC TAT -3'。

1.3.10 Western blot检测蛋白 用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞或组织，BCA试剂盒检测蛋白浓度，99 ℃变性。10 μg蛋白上样进行聚丙烯凝胶电泳，300 mA恒流1.5 h转膜至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温避光孵育1 h，曝光获得目的条带。用Image J软件对条带进行灰度值分析。抗体和稀释倍数如下：CD146（1:1 000）、P-p38（1:1 000）、p38（1:1 000）、RHOA（1:1 000），β-Actin（1:1 000）作为内参。

1.3.11 RNA收集和定量PCR 用Trizol法提取细胞和组织中的RNA，测浓度后，取1 μg RNA进行逆转录合成cDNA，取1 μl cDNA作为模板，加入靶基因上下游引物，用定量PCR仪进行扩增。各引物序列见表1。

表1.引物序列Table 1.Sequences of primers

1.4 统计学方法

实验研究。采用SPSS 20.0统计软件进行分析。各组实验数据符合正态分布且方差齐，以表示。组间数据比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD146在小鼠视网膜和HRMEC中的表达

P17正常和OIR小鼠的视网膜切片免疫荧光染色结果显示，CD146和视网膜血管共染，见图1A。Western blot结果显示，OIR小鼠视网膜中CD146的蛋白表达是正常小鼠的2倍（t=5.62，P=0.001），见图1B。用免疫磁珠法分离P17 正常和OIR小鼠视网膜的血管内皮细胞，定量PCR结果显示，OIR组小鼠视网膜血管内皮细胞中CD146 mRNA表达水平是正常小鼠的2 倍（t=6.57，P=0.003），见图1C。为了进一步探究缺氧对视网膜血管内皮细胞中CD146 表达的影响，将HRMEC置于1% O2培养箱中培养，Western blot结果显示，缺氧环境中HRMEC上的CD146 表达是正常组的2 倍（t=5.79，P=0.010），见图1D。

图1.CD146在小鼠视网膜和HRMEC中的表达情况A：免疫荧光染色检测CD146 在正常小鼠和OIR小鼠视网膜上的表达，其中红色为视网膜血管GS-ib4染色，绿色为CD146染色，蓝色为DAPI染色细胞核，比例尺：50 μm。B：Western blot检测P17正常小鼠和OIR小鼠视网膜中CD146蛋白的表达，β-Actin作为内参。C：定量PCR检测P17正常小鼠和OIR小鼠视网膜血管内皮细胞中CD146 mRNA的表达情况（n=4；b，与正常小鼠比，P＜0.01）。D：缺氧环境下Western blot检测HRMEC中CD146蛋白表达Figure 1.The expression of CD146 in mouse retina and HRMECA: Immunofluorescent staining detected the expression and location of CD146 in retinal sections of OIR and normal mice at P17,red was GS-ib4 stain for vascular,green was CD146 staining,blue was DAPI stain for nucleus,scale bar was 50 μm.B: Western blot assay determined the protein expression of CD146 in OIR and normal mouse retina,β-Actin was used as the internal reference.C: Real-time quantitative PCR detected the mRNA level of CD146 in isolated mouse retinal endothelial cells of OIR and normal mice at P17 (n=4;b,compared with the normal mice,P＜0.01).D:Western blot detected the protein expression of CD146 in HRMEC under hypoxic conditions.OIR,oxygen induced retinopathy;CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells.

2.2 CD146对HRMEC的活力、增殖、周期的影响

为了防止脱靶效应，设计2条不同的siRNA链（siCD146-1 和siCD146-2）转染细胞，敲减CD146蛋白表达。Western blot和定量PCR结果显示，CD146的表达下降60%以上（siCD146-1：t=5.70，P=0.005；siCD146-2：t=5.92，P=0.004），见图2A—B。MTS、EDU和流式细胞术结果显示：与NC组相比，siCD146-1和siCD146-2的细胞活力（siCD146-1：t=0.09，P=0.931；siCD146-2：t=0.13，P=0.903）、增殖（siCD146-1：t=0.09，P=0.931；siCD146-2：t=0.29，P=0.781）和细胞周期（G1：siCD146-1：t=0.28，P=0.791；siCD146-2：t=0.35，P=0.741。G2：siCD146-1：t=1.87，P=0.134；siCD146-2：t=2.29，P=0.083。S：siCD146-1：t=0.27，P=0.798；siCD146-2：t=0.20，P=0.845）均无明显变化，见图2C—E。

图2.CD146对HRMEC的细胞活力、增殖和细胞周期的影响A：Western blot检测CD146在siRNA转染的HRMEC中的敲减效率。B：定量PCR检测siCD146在HRMEC中的敲减效率；b，与阴性对照组比，P＜0.01。C：EDU实验检测siCD146组和NC组中细胞增殖情况，红色为EDU染色，蓝色为DAPI细胞核染色，比例尺：100 μm。D：MTS检测细胞活力。E：流式细胞术检测siCD146组和NC组的细胞周期。G1，DNA合成前期；S，DNA合成期；G2，DNA合成后期Figure 2.The effect of siCD146 on MTS,EDU and the cell cycleA: Western blot assay determined the protein expression of CD146 in HRMEC after CD146 and NC siRNA transfection.B: Real-time quantitative PCR detected the mRNA level of CD146 in siCD146 groups and NC groups.b,compared with the regative control,P＜0.01.C: EDU assay detected the ability of HRMEC proliferation,red was EDU stain for proliferating cells,blue was DAPI stain for nucleus,scale bar was 100 μm.D: MTS assay tested HRMEC viability.E: Flow cytometry determined the cell cycle of siCD146 and siNC groups.G1,first gap;S,synthesis;G2,second gap;CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells;OD,optical density;NC,negative control.

2.3 CD146对HRMEC迁移和血管形成的影响

划痕实验结果显示，与NC组相比，siCD146转染组细胞的迁移面积明显减少（siCD146-1：t=2.73，P=0.041；siCD146-2：t=4.10，P=0.006），见图3A；迁移特异性实验即Transwell实验进一步显示，与NC组相比，siCD146 转染组迁移到下室的细胞数量明显减少（siCD146-1：t=6.15，P=0.003；siCD146-2：t=3.88，P=0.005），见图3B。血管形成实验结果显示，与NC组相比，siCD146转染组血管形成能力明显减弱（siCD146-1：t=2.81，P=0.048；siCD146-2：t=3.10，P=0.036），见图3C。

图3.CD146对HRMEC迁移和血管形成的影响A：划痕实验检测细胞迁移情况；B：Transwell实验检测细胞迁移情况；C：血管形成实验检测细胞的血管生成能力。比例尺：50 μmFigure 3.The effects of CD146 on the ability of migration and tube formation of HRMECA: Scratch assay tested the effects of CD146 knockdown on HRMEC migration.B: Migratory specific transwell assay further determined the migratory ability in the CD146 siRNA transfected HRMECs.C: The matrigel-based angiogenesis assay tested the effects of CD146 on tube formation.Scale bar was 50 μm.CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells;NC,negative control.

2.4 CD146对HRMEC中迁移相关蛋白的影响

CD146 敲减可以明显抑制HRMEC的迁移和血管形成，故本研究采用定量PCR检测迁移及血管生成相关的基因，结果显示VEGF（siCD146-1：t=5.15，P=0.007；siCD146-2：t=5.97，P=0.004）和RHOA（siCD146-1：t=2.95，P=0.042；siCD146-2：t=2.89，P=0.046）的mRNA水平在siCD146 转染组中明显下调，见图4A。Western blot进一步检测蛋白及相关通路蛋白结果显示，与NC 组相比，siCD146转染组中RHOA（siCD146-1：t=3.60，P=0.023；siCD146-2：t=4.12，P=0.015）和P-p38（siCD146-1：t=2.89，P=0.044；siCD146-2：t=3.07，P=0.038）表达均下调，见图4B。

图4.CD146对HRMEC中血管生成和迁移相关蛋白的影响A：定量PCR检测血管内皮细胞迁移、血管生成相关的基因；B：Western blot检测siCD146转染后对HRMEC中RHOA和P-p38蛋白的影响。a，与NC组相比，P＜0.05；b，与NC组相比，P＜0.01Figure 4.The effects of CD146 on the expression of angiogenesisrelated proteins in HRMECA: Quantitative PCR determined the expression of angiogenesis-related gene.B: Western blot detected RHOA protein,P-p38 protein expression in HRMEC after CD146 and NC siRNA transfection.P-p38,phospho-p38 MAPK;RHOA,ras homolog gene family member A;CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells;NC,negative control.a,compared with the control,P＜0.05;b,compared with the control,P＜0.01.

2.5 玻璃体腔注射siCD146 对小鼠视网膜新生血管的影响

本研究采用小鼠玻璃体腔注射siRNA方法进行视网膜中CD146的敲减。OIR模型制作后，在小鼠P13 对右眼玻璃体腔内注射siCD146，左眼注射无意义小干扰PNA作为对照组NC。定量PCR检测注射效率显示，与左眼相比，右眼中CD146 mRNA表达下调50%（t=7.48，P=0.005），见图5A。视网膜铺片结果显示，siCD146注射组的视网膜新生血管明显减少（t=8.94，P=0.001），无血管区也减少（t=11.24，P=0.001），见图5B。视网膜蛋白Western blot显示，与NC组相比，注射siCD146组中的CD146（t=5.62，P=0.030）、P-p38（t=6.87，P=0.021）、RHOA（t=5.06，P=0.037）表达均下调，见图5C。

图5.CD146敲减对OIR小鼠视网膜新生血管的影响A：定量PCR检测玻璃体腔注射NC组和CD146 siRNA的效率（n=5，b，与对照组相比，P＜0.01）；B：玻璃体腔注射siCD146 后，OIR小鼠P17视网膜血管铺片图，比例尺：500 μm；C：Western blot检测视网膜中RHOA、P-p38和p38蛋白的表达Figure 5.CD146 knockdown alleviated OIR retinal neovascularizationA: Quantitative PCR detected the efficiency of vitreous injection of CD146 siRNA (n=5;b,compared with NC,P＜0.01).B: Retinal flat-mount images,scale bar was 500 μm.C: Western blot detected RHOA protein,P-p38 and p38 protein expression in the retina.P-p38,phospho-p38 MAPK;RHOA,ras homolog gene family member A;CD146,cluster of differentiation 146;OIR,oxygen induced retinopathy;NC,negative control.

3 讨论

CD146是已知的肿瘤新生血管的重要标记物，在各种肿瘤新生血管的发生、发展中都发挥着重要的作用[10]。本研究发现CD146 在视网膜血管中特异性表达，而在视网膜的其他组织中未见表达，且在视网膜新生血管内皮细胞中的表达升高，提示其参与了视网膜新生血管的发生过程。视网膜血管内皮细胞是新生血管的重要参与者，而缺氧是新生血管的重要诱因[11]。OIR小鼠模型在P7～P12放置于75% O2环境中，之后在正常氧环境中饲养，相对于75% O2是缺氧的环境，从而诱发了视网膜的新生血管，故本研究进一步采用了视网膜血管内皮细胞在1% O2处理来模拟血管内皮细胞的缺氧环境，结果发现在缺氧条件下HRMEC中CD146 表达升高。与本研究结果一致，Abu El-Asra等[12]研究还发现CD146在糖尿病大鼠视网膜中表达明显升高，提示CD146 在缺氧诱导的视网膜新生血管中发挥重要的作用。

本研究进一步发现敲减CD146 可以明显抑制视网膜血管内皮细胞的迁移和血管形成，而对视网膜血管内皮细胞的增殖影响不大。由于在OIR小鼠模型中，同窝小鼠视网膜新生血管情况差异较大，故本研究选择同一小鼠左眼玻璃体腔注射NC siRNA作为对照，右眼注射CD146 siRNA作为观察，减少不同小鼠之间引起的差异。本研究显示，在视网膜中使用体内转染试剂PEI和siRNA一起转染，注射2 μl（100 μmol/L）siCD146，可以明显敲减视网膜中CD146 mRNA和蛋白的表达，并能明显抑制新生血管。而以往研究发现在乳腺癌细胞[13]中敲减CD146可以抑制细胞的增殖和迁移，故推测CD146在视网膜血管内皮细胞中对与增殖相关的基因影响不大，主要通过影响细胞迁移从而影响血管生成。

为了探究CD146 对血管内皮细胞迁移的影响机制，在HRMEC上敲减CD146后检测细胞迁移相关基因，发现VEGFA mRNA、RHOA mRNA和蛋白表达水平都明显下调，而VEGF蛋白没有明显差异。在视网膜中敲减CD146后主要引起Rhoa蛋白表达下调。Rho小G蛋白在血管内皮细胞的骨架重塑、细胞粘附和细胞间连接中都发挥着重要作用，从而调节血管形成。RHOA是其中一员，通过肌动蛋白丝与其运动蛋白非肌动蛋白II的组装诱导应力纤维形成，从而影响细胞的迁移[14]。以往研究发现RHOA参与调控视网膜新生血管的形成，并且抑制RHOA通路在体外可以明显抑制血管生成[15]。本研究在HREMC上敲减CD146，虽然引起VEGF mRNA 水平的稍微下调，但主要是影响RHOA mRNA和蛋白水平的表达。另外，在视网膜中注射siCD146后，主要引起视网膜中RHOA蛋白表达明显下调。RHOA是细胞迁移的重要参与者，故最终能影响新生血管形成。与本研究结果一致，CD146在黑色素瘤细胞[16]和乳腺癌细胞[17]中可以通过激活RHOA促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。除此之外，许多信号通路都参与新生血管的生成过程，其中p38 是丝裂原活化蛋白激酶，经外界刺激而激活，引起细胞内蛋白激酶的连锁反应。激活p38信号通路可以引起细胞有丝分裂及细胞迁移[18]。本研究发现在HRMEC和视网膜中敲减CD146后P-p38蛋白表达明显下调，故可以在体内、体外抑制新生血管。利用CD146敲除的小鼠研究发现，CD146缺失的内皮细胞通过抑制p38通路的激活从而抑制细胞的迁移能力和血管生成能力[19]。

综上所述，敲减视网膜血管内皮细胞上CD146可以通过抑制RHOA/p38信号轴，来进一步抑制血管的迁移从而减少视网膜新生血管的形成，提示CD146 可以作为临床上治疗视网膜新生血管的新靶点，为临床治疗视网膜新生血管相关疾病提供新的理论依据和策略。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明林永：参与收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释，撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。杨汝森：参与收集数据和实施研究，撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。闫东升、陈晓燕：参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行修改。吕帆：指导课题设计，修改论文；根据编辑部的修改意见进行修改