枸杞子治疗干眼症的作用靶点及相关机制的网络药理学研究

高青 庞庆宝 孙河

干眼症又被称为角结膜干燥症，是以泪膜失衡和伴随眼部症状为特征的多因素眼表疾病，其中泪膜不稳定和高渗透性，眼表炎症和损伤及感觉神经异常在发病机制中起重要作用[1]。临床表现主要有眼部干涩、烧灼感、异物感、刺激感、畏光、眼红、视力下降、视物模糊、视力波动、视久疲劳、眼痒、流泪或视物的清晰度下降等。国际调查显示干眼发病率为7%～33%，其中女性、老年人、亚洲人均为高发人群[2]，干眼症已被列为全球流行性疾病[3]，在我国的发病率也达21%～30%[4]。目前西医治疗干眼症主要有人工泪液、抗炎和免疫抑制剂、性激素替代、抗生素、手术等方法，但是均可产生一系列不良反应或依赖性[5]。因此越来越多的学者关注中医治疗干眼症。

枸杞子作为药食同源的一味中药，已有3 千多年的历史，最早见于《神农本草经》：“味平、性甘，归肝、肾、肺经”，具有养肝滋肾，益精明目，润肺止咳的功效。枸杞子含有枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）、类胡萝卜素、甜菜碱、枸杞总黄酮（Total flavonoids of Lycium barbarum，TFLB）、氨基酸、微量元素及其他成分。研究发现枸杞子具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎杀菌、降压、降脂、降糖、保肝、明目、保护神经等作用，甚至还能双向调节免疫[6]。枸杞子对干眼症的治疗效果可能是通过控制一系列血清蛋白和信号通路来调节泪腺分泌和泪液生成[6]。尽管枸杞子含有多种已知成分，但其治疗干眼症的有效物质和作用机制尚未清楚。

网络药理学主要应用生物学、生物信息技术、生物网络分析等知识揭示药物多成分、多靶点、多疾病之间的有效作用机制。它强调药物与疾病之间的系统和整体关系，与古代中医基础理论的“整体观念”一致[7]。本研究主要利用网络药理学寻找枸杞子治疗干眼症的有效物质、关键靶点和信号通路的相关机制。

1 材料与方法

1.1 枸杞子活性成分和靶点的筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库中（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），将“枸杞子”作为关键词，筛选条件设为“药物靶点”，筛选口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30.00%且类药性（Drug like，DL）≥0.18的成分，获得枸杞子中的活性成分及相关靶点。

1.2 枸杞子治疗干眼症相关靶点筛选

在GeneCards和OMIM数据库中，将“Dry eye”作为关键词，挖掘与干眼症相关的基因靶点，删除重复值后整理数据，通过Venny工具将枸杞子与干眼症的相关靶点取交集并绘制Venny图，交集基因即关键基因。

1.3 网络图的构建与分析

将干眼症和枸杞子的交叉靶点数据输入Cytoscape 3.9.0软件构建“疾病-中药-成分-靶点”网络图。不同的网络节点分别代表干眼症、中药枸杞子、枸杞子的有效成分以及干眼症和枸杞子的共同靶点；节点之间的连接线代表相互关系和影响。

1.4 网络构建与核心靶点筛选

将干眼症和枸杞子的共同靶点输入STRING数据库（http://string-db.org），限定物种为“Homo sapiens”，其余均为默认设置，构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络。结果导入Cytoscape 3.9.0软件进行可视化分析：去除游离节点，使用CentiScape 中“度中心性（Degree centrality，DC）”算法计算degree值（D值）评估网络中基因节点的重要性，筛选 PPI网络核心靶点，选取D值前9位的基因作为核心基因并进行可视化。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用R编程语言对上述过程中获得的交叉靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，选取阈值P＜0.05的结果。根据输出结果，分析枸杞子治疗干眼症的可能机制。

2 结果

2.1 枸杞子中有效成分的筛选

经过严格筛选，共检索到31 个枸杞子活性成分。其中15个活性成分见表1。

表1.枸杞子的15个活性成分Table 1.Fifteen active ingredients of Lycium barbarum

2.2 枸杞子治疗干眼症相关靶点的预测结果

总共收集到50个枸杞子活性成分靶点和875个干眼症靶点，获得枸杞子和干眼症靶点之间的交集，并构建了一个维恩图，其中包含总共45个相交靶点。

2.3 “疾病-中药-成分-靶点”网络图

如图1所示，图中紫色三角形代表中药枸杞子，红色菱形代表干眼症，绿色方形代表枸杞子的有效成分，蓝色圆形代表中药枸杞子和干眼症的共同靶点。枸杞子主要通过31种有效成分作用于45个靶点，反映了枸杞子治疗干眼症的多成分、多靶点作用。其中槲皮素、β-谷甾醇、黄豆黄素和豆甾醇的D值最高，是枸杞子治疗干眼症的主要活性成分。

图1.枸杞子治疗干眼症“疾病-中药-成分-靶点”网络图紫色三角形代表中药枸杞子，红色菱形代表干眼症，绿色方形代表枸杞子的有效成分，蓝色圆形代表中药枸杞子和干眼症的共同靶点。连接每个节点的直线表示节点之间存在调节关系Figure 1.＂Disease-herbal-component-target＂ network diagram of Lycium barbarum for dry eyeThe purple triangle represents the herbal Lycium barbarum,the red diamond represents the dry eye disease,the green square represents the active ingredient of Lycium barbarum,and the blue circle represents the common target of the herbal Lycium barbarum and the dry eye disease.The straight line connecting each node indicates the existence of a regulatory relationship between the nodes.

2.4 PPI网络的分析结果

在STRING数据库中输入45 个共同靶点，获得蛋白相互作用的关系，并绘制关键基因PPI网络图（见图2），PPI网络最终包含45个节点和403条边缘，节点平均度值为17.9。有20 个节点度值高于平均水平，应将其视为关键核心靶点。根据“接近中心”原则，用Cytoscape 3.9.0绘制45个节点；节点的颜色与节点对网络的贡献呈正相关。从图3 可以看出，接近中心的高值靶蛋白包括缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factors，HIF1A）、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、骨髓细胞瘤病病毒性肿瘤基因（Myelocytomatosis viral oncogene，MYC）、血管内皮生长因子 A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、半胱天冬酶-3（Cystathione-3，CASP3）、细胞周期蛋白D1（Cell cycle protein D1，CCND1）、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2（Receptor tyrosine protein kinase erbB-2，ERBB2）、过氧化物酶体增殖物激活的受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、低聚果糖（Fructo oligosaccharide，FOS）、NF-kappa-B 抑制剂α（NF-kappa-B inhibitor alpha，NFKBIA）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteine aspartate protease，CASP8）等。这些是PPI网络中的关键核心靶点，因此可能在枸杞子治疗干眼症中发挥重要作用。图3中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联性。D值排名靠前12的蛋白，依次为HIF1A、EGFR、IL-6、MYC、VEGFA、CASP3、CCND1、ERBB2、PPARG、FOS、NFKBIA、CASP8（见表2）。

图2.枸杞子治疗干眼的关键基因蛋白相互作用网络图Figure 2.Protein interactions network map of key genes in Lycium barbarum for the treatment of dry eyes

图3.枸杞子治疗干眼的关键靶点度值网络图节点的颜色和大小反映度值。图中的节点越大、颜色越红，DC值越大Figure 3.Network diagram of the degree values of the key targets of Lycium barbarum for the treatment of dry eyesThe color and size of the nodes reflect the degree value.The larger and redder was the node in the graph,the larger was the DC value.DC,degree centrality.

表2.靶蛋白的网络拓扑特性（D≥24）Table 2.Network topology properties of target proteins(D≥24)

2.5 GO功能富集分析

通过GO功能富集分析，共获得生物过程71个，主要涉及DNA转录的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、泛素样蛋白连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合、激酶调节活性、DNA结合转录激活活性，RNA聚合酶II特异性、蛋白激酶调节活性、box结合蛋白过程、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控、炎性反应、基因表达的正调控等，其中表3所示为靶点数＞5的生物过程。以上结果表明，枸杞子通过对这些生物分子的调节来治疗干眼症。

表3.“枸杞子-干眼症”的GO分析结果Table 3.Results of GO analysis for “Lycium barbarum-dry eye disease”

2.6 KEGG通路富集分析

枸杞子与干眼症的45个相关靶点涉及97条信号通路，包括脂质与动脉粥样硬化通路、化学致癌-受体激活通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白多糖通路、人巨细胞病毒感染通路、微小RNA与癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、p53信号通路等。因此，枸杞子可能通过相关靶点调节这些信号通路对干眼症产生影响（见表4）。

表4.枸杞子KEGG靶点通路富集结果（靶点＞10）Table 4.KEGG target pathway enrichment results (targets＞10)

3 讨论

本研究通过网络药理学方法分析中药枸杞子治疗干眼症的药理机制，发现枸杞子的45 种活性成分当中有31 种活性成分与干眼症有关，其中关键活性成分为总黄酮类化合物和类固醇化合物，包括槲皮素、黄豆黄素、β-谷甾醇、豆甾醇等。本研究采用PPI网络拓扑参数进行核心网络的筛选，收集到枸杞子治疗干眼症的29 个关键靶点，包括HIF1A、EGFR、IL-6、MYC、VEGFA、CASP3、CCND1、ERBB2、PPARG、FOS、NFKBIA、CASP8 等。其中HIF1A、EGFR、IL-6、VEGFA、CASP3、PPARG可能在治疗中发挥主要作用。同时，本研究通过GO功能富集分析，共获得生物过程71个，分析得出枸杞子可能是通过对激素的反应、细胞凋亡、上皮细胞增殖、转录因子结合、细胞对应激的反应、对细胞因子的反应等生物学过程治疗干眼症，大多数基因可富集到癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活、卡波西肉瘤相关性疱疹病毒感染、PI3K-Akt、NF-kappa-B、VEGF、AGE-RAGE等信号通路。

研究已发现黄酮醇类物质主要有免疫调节、降血糖（抑制α-葡萄糖苷酶等）、抗菌、抗炎、降血脂、抗氧化[8-9]、快速清除体内自由基等生物活性，可有效抑制IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌[10]，还可以抗衰老（抑制胆碱酯酶）、抗病毒[11]。槲皮素作为黄酮醇类物质的代表之一，还能抗新生血管生成，抗菌以金黄色葡萄球菌（引起眼表炎症的重要细菌之一）为主[12]，是一种治疗干眼症的有效成分。徐小娟等[13]认为槲皮素在体内外均可抑制肿瘤细胞的生长、转移，从而诱导发生凋亡、自噬。研究发现槲皮素除了能够直接抑制mTOR的活性，还能激活PI3K-Akt信号通路起到抗癌效果[14]。而PI3K-Akt是参与细胞的增殖、分化、凋亡的重要通路，在肿瘤、心血管、糖尿病等方面均有影响[15]；该通路还参与细胞转化过程，能够调节转录因子结合以及炎症反应。类固醇化合物β-谷甾醇也能抑制肿瘤生长、促肿瘤细胞凋亡、调节免疫和抗氧化[16-18]。豆甾醇可以调节血脂，降低循环系统疾病的风险，还可抑制NF-KB信号通路而起到抗炎作用[19]。

HIF1A是缺氧信号的转导中枢，可影响细胞的增生、自噬、凋亡过程，还可调控免疫细胞和促炎性因子（如白介素）的表达[20]。EGFR通过调控细胞的增殖、分化，在泪液中稳定眼表的内环境，可影响干眼的发生、发展[21]。IL-6作为一种促炎性因子，可加剧炎症反应，破坏上皮细胞蛋白的表达，诱导上皮细胞凋亡，升高泪液渗透压[22]，使得泪膜不稳定或破坏。有研究发现干眼患者泪液中和角膜上皮均测出IL-6等炎性因子的水平增加[23]，因此IL-6 的大量释放可诱发炎症反应，引起干眼症状。VEGFA作为影响角膜损伤[24]的重要蛋白，可因糖尿病晚期糖基化而发生角膜神经病变[25]，泪腺分泌受到抑制，患者出现干眼症状，由此可推测枸杞子治疗干眼症可能与抑制角膜上皮损伤相关。另外，VEGFA能影响血管通透性、炎症刺激和产生新生血管，促使炎症反应形成并形成恶性循环[26]。王超群等[27]实验检测发现CASP3和CASP8在干眼模型的结膜上皮细胞中均升高，说明这2个指标可能与干眼症的发生有关。由此可推断枸杞子能够通过抑制细胞凋亡而治疗干眼症。RAGE分布于眼部组织的巨噬细胞及内皮细胞中，在应激状态下，AGE与RAGE结合，激活多种细胞信号转导通路，诱导炎症反应、氧化应激，破坏相关蛋白，可引起更大的炎症反应[28]。

目前干眼症的发生主要是各种刺激（应激反应、激素失衡和神经机能障碍）影响正常的眼表修复和防御功能，导致泪膜不稳定、泪腺和眼表组织呈慢性炎症状态[29]。各种炎性因子释放，激活不同的信号通路，细胞核接收讯号，从而调控相关基因、蛋白的表达，最终影响细胞的生长、发育和功能。本研究通过查阅国内外相关文献，构建成分-靶点-通路-疾病网络，对枸杞子治疗干眼症的关键靶点及通路进行了初步归纳、分析，推测枸杞子可能是通过对EGFR、IL-6、VEGFA、CASP3等基因的影响，以及对癌症通路、PI3K-Akt、NF-kappa-B、VEGF、AGE-RAGE等信号通路的调控，抑制炎症因子释放，减少细胞凋亡，调节免疫应答，改善血液循环及氧代谢，改善干眼症患者的主观症状及临床指标。根据对干眼症关键基因的富集，发现在诸多通路中，NF-kappa-B通路起到重要作用，核转录因子（Nuclear transcription factor-kB，NF-kB）激活后可抑制因为各种不良因素损伤细胞而产生的促细胞凋亡过程。该通路能影响细胞的无限增殖和抗凋亡，调控炎症及免疫表达，另外激活NF-KB可抑制TNF-α引起的细胞凋亡[30]。当NF-KB激活后，调控细胞因子转录，反过来炎性因子表达的增强又进一步增强NF-KB活性，引起炎症加重[31]。此外，眼表上皮结构破坏，也可引起细胞凋亡的发生，故干眼症的发生可能与炎症及细胞凋亡均有关系。

通过本研究可知中药枸杞子能够通过其活性成分针对多靶点、多通路联合作用的机制来治疗干眼症。本研究可为枸杞子治疗干眼症提供一定依据，为将来的进一步实验研究提供方向，也可为临床治疗干眼症的复方配伍提供思路。后续基于本研究结果，将对筛选出的相关靶点和信号通路继续开展细胞及动物水平的研究验证。

利益冲突申明无任何利益冲突

作者贡献声明高青：收集数据；参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。庞庆宝：参与选题、设计、资料的分析和解释；修改论文中关键性结果、结论；根据编辑部的修改意见进行核修。孙河：参与选题、设计和修改论文的结果、结论