大丽轮枝菌果胶裂解酶PL1家族基因VdPL14的致病功能研究

姜明 谭明琪 王丹 张丹丹 陈捷胤

摘要

大麗轮枝菌Verticillium dahliae引起的黄萎病是一种传播迅速且为害广泛的土传维管束真菌病害。大丽轮枝菌分泌的水解酶在侵染中发挥重要作用，尤其是纤维素酶和果胶酶。大丽轮枝菌果胶裂解酶包括PL1、PL3、PL4、PL9和PL11 5个家族，其中PL1家族成员数目最多，但对该家族的致病功能还未见系统研究。本研究明确大丽轮枝菌PL1家族共包含17个成员，且多数成员在侵染早期上调表达，其中VdPL14和VdPL18在侵染早期强烈诱导表达。挑选VdPL14构建缺失突变体，发现VdPL14缺失后菌株对棉花的致病力显著下降，对复杂碳源（果胶、羧甲基纤维素、淀粉）的利用能力受限，该基因回补后菌株的毒力和碳源利用能力均得以恢复。信号肽介导的分泌活性验证表明VdPL14为分泌蛋白。以上研究表明，VdPL14是重要毒力因子，研究结果为后续系统解析果胶裂解酶在病原致病过程中发挥的作用提供了理论依据。

关键词

大丽轮枝菌; 果胶裂解酶; PL1家族; 毒力

中图分类号：

S 423.23

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022105

Functional analyses of pectate lyase family 1 gene VdPL14 in the pathogenicity of Verticillium dahliae

JIANG Ming1#， TAN Mingqi1，2#， WANG Dan2， ZHANG Dandan2， CHEN Jieyin2*

（1. College of Life Sciences and Technology， Mudanjiang Normal University， Mudanjiang 157012， China;

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Verticillium wilt caused by Verticillium dahliae is a rapidly spreading soilborne vascular fungal disease. Hydrolytic enzymes， especially cellulases and pectases produced by V.dahliae， play an important role during infection. Pectate lyases in V.dahliae comprise PL1， PL3， PL4， PL9， and PL11 families. Among them， the PL1 family has the largest number of proteins， but there is no systematic understanding of the pathogenic function of this family. This study showed that the pectate lyase of PL1 family from V.dahliae contained 17 members， and most of them showed up regulation of expression in the early stage of infection. The expressions of VdPL14 and VdPL18 were strongly induced in the early stages of infection. VdPL14 was selected to construct deletion mutants， and it was found that the growth of the deletion mutants of VdPL14 was inhibited on different complex carbon sources （pectin， carboxymethyl cellulose， starch） and they were significantly less virulent. The virulence and carbon utilization capacity of the complementary strains were restored to the levels of the wild type strain. Verification of secretory activity mediated by signal peptide showed that VdPL14 was secretory protein. The gene VdPL14 is therefore an important virulence factor in V.dahliae， and this study provides a strong theoretical basis for the subsequent systematic analysis of the roles of the pectate lyase genes of PL1 family in V.dahliae pathogenesis.

Key words

Verticillium dahliae; pectate lyase; PL1 family; virulence

果胶是一种结构复杂的天然植物多糖，大量存在于果皮以及植物细胞壁中，其合成需要糖基转移酶、甲基转移酶等多种酶类参与［12］。果胶包括同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、木糖半乳糖醛酸聚糖（XGA）和两种鼠李半乳糖醛酸聚糖（RGⅠ和RGⅡ）等［3］。果胶是植物初生细胞壁的主要非纤维素成分，在大多数高等植物细胞壁中含量超过30%，对细胞间黏附和维持细胞壁结构稳定具有重要作用［4］。果胶酶分为原果胶酶（protopectinase）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）、果胶裂解酶（pectate lyase）和果胶酯酶等（pectinesterase），通过不同机制降解果胶基质［5］。果胶裂解酶通过β消除反应切割α1，4糖苷键，降解去甲酯化果胶，以此来保持细胞壁的完整性和凝聚力［6］。

在微生物与植物互作过程中，病原微生物分泌的果胶裂解酶在降解植物细胞壁中发挥重要作用，其通常于侵染植物早期分泌，是一种潜在的毒力因子。如苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea果胶裂解酶Bdpl1参与寄主果胶类物质的降解［7］;球炭疽菌Colletotrichum coccodes中果胶裂解酶基因CcpelA过表达后其致病性增强［8］;辣椒疫霉Phytophthora capsici果胶裂解酶PcPL1、PcPL15、PcPL16和PcPL20在辣椒叶中瞬时表达后引起寄主细胞死亡［9］;菜豆炭疽病菌Colletotrichum lindemuthianum果胶裂解酶基因pecCl1的失活减轻了炭疽病的症状［10］。这些研究结果揭示了病原菌能够利用自身外泌的果胶裂解酶参与致病过程。

作物黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的一种土传性维管束病害。大丽轮枝菌寄主十分广泛，能够侵染600余种双子叶植物，其中包括180余种农作物［1112］。大丽轮枝菌通过微菌核发育形成菌丝与根部接触，菌丝突破根的皮层进入导管定殖，随着植物蒸腾作用，菌丝和孢子沿着导管系统向寄主组织顶端扩散，最终引起植物黄化萎蔫［13］。比较基因组学分析发现，相较其他叶部病原真菌，大丽轮枝菌编码的碳水化合物酶类更多，尤其是纤维素酶和果胶酶，推测这两种酶可能对大丽轮枝菌在寄主导管中定殖和扩繁发挥重要作用［1415］。大丽轮枝菌果胶裂解酶VdPL3.1和 VdPL3.3 参与植物细胞壁降解，在其致病过程中发挥重要作用［16］。VdPEL1可诱导多種植物叶片坏死，激发烟草和棉花植株的抗性防御反应［17］。转录因子VdFTF1则通过调控细胞壁降解功能基因的表达参与致病过程，其调控的PL1家族基因VEDA_09651敲除后大丽轮枝菌对寄主棉花的致病力显著下降［18］。

比较基因组学研究发现，大丽轮枝菌的基因组编码丰富的果胶裂解酶，主要包括PL1、PL3、PL4、PL9和PL11 5个家族，其中PL1家族的蛋白数目最多［14］，但目前对其致病功能尚未开展系统研究。因此，本研究拟系统梳理大丽轮枝菌PL1家族成员概况及寄主诱导下该家族基因的表达特性，并通过对代表基因VdPL14敲除突变体和回补转化株开展碳源利用、致病力鉴定及蛋白信号肽外泌活性检测等试验，明确VdPL14在大丽轮枝菌侵染和致病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

菌株：大丽轮枝菌野生型菌株Vd991、酵母菌株YTK12、YTK12SPAvr1b为本实验室保存;根癌农杆菌AGL1购自上海唯地生物技术有限公司，用于遗传转化;大肠杆菌DH5α购自诺唯赞生物科技股份有限公司，用于遗传转化。

质粒：pGKO2Hyg用于基因敲除，pSUC2用于酵母信号肽活性验证，pCOM用于回补载体构建。均在本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

试剂：卡那霉素、乙酰丁香酮，Coolaber公司;头孢霉素，生工生物工程（上海）股份有限公司;F2dU，北京索莱宝科技有限公司;潮霉素，上海罗氏制药有限公司;以上均用于加入培养基作抗生素使用。新型植物DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司; RNA提取试剂盒，Aidlab Biotechnologies公司;RNA反转录试剂盒，北京全式金生物技术有限公司;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，Vazyme公司。

仪器：小型高速离心机，德国艾本德;PCR扩增仪、荧光定量PCR仪，BioRad公司;恒温金属浴，天根生化科技（北京）有限公司;pH计，梅特勒托利多公司;生物显微镜，Olympus Corporation。

1.1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂15 g/L;PDA培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L;CM培养基（complete medium）：酵母提取物6 g/L、酸水解酪蛋白 6 g/L、蔗糖10 g/L;查氏培养基（CzapekDox medium）：NaNO3 2 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·H2O 0.001 8 g/L、K2HPO4·3H2O 1.31 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂15 g/L;不同碳源培养基：将查氏培养基中30 g/L蔗糖分别替换为17 g/L淀粉、10 g/L果胶或10 g/L羧甲基纤维素;MM培养基（minimal medium）：200 g/L K2HPO4与145 g/L KH2PO4混合后以10 mL/L的量加入，30 g/L MgSO4·7H2O与15 g/L NaCl混合后以20 mL/L的量加入，1% CaCl2·2H2O 1 mL/L，葡萄糖2 g/L，0.01% FeSO4 10 mL/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L、CuSO4·5H2O 0.1 g/L、硼酸0.1 g/L、0.1 g/L MnSO4·7H2O与0.1 g/L钼酸钠混合后以5 mL/L的量加入，20 g NH4NO3和100 mL蒸馏水混合后以2.5 mL/L的量加入，最后将pH调至7.0。IM培养基（induction medium）：配方与MM培养基相似，除需添加上述药品外还需添加2（N吗啉）乙磺酸一水物8.53 g/L与甘油25 mL/L，将pH调至6.0。

CMDW培养基：无氨基酸酵母氮源6.7 g/L， Tryptophan dropout supplement 0.75 g/L， 蔗糖20 g/L，葡萄糖1 g/L;YPRAA培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，棉子糖20 g/L。

1.1.4 PL1家族基因生物信息学分析

PL1家族基因信息来源于大丽轮枝菌菌株Vd991基因组测序信息，包括其GeneID、CDS序列、PEP序列等。利用SMART（http：∥smart.emblheidelberg.de/）对PL1家族成员的蛋白结构进行预测。用BioEdit进行多序列比对，采用MEGA 6使用最大似然法构建（参数1 000，JonesTaylorThornton模型）系统发育树。

1.2 PL1家族基因表达特性分析

孢子悬浮液制备：将大丽轮枝菌菌株Vd991接入CM培养基中，于25℃，150 r/min培养3～4 d后用无菌滤布过滤菌丝，调整孢子浓度至5×106个/mL，获得孢子悬浮液。

将表面消毒的棉花种子种入无菌土（蛭石∶营养土=2∶3）中，于25℃光照培养箱内培养（L∥D=16 h∥8 h）。待棉花幼苗第一片真叶伸展后，将棉花幼苗拔出，將根部浸于250 mL浓度为5×106个/mL 的Vd991孢子悬浮液中，30 min后移栽至无菌土中继续培养。分别于0、1、2、3、5、7、9 d时收取棉花根部样品（0 d收集样品作为基因表达的对照，将其相对表达量当作1），提取RNA并反转录合成cDNA，利用RTqPCR定量分析PL1家族基因在侵染过程中的表达情况。

采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。反应条件：95℃预变性3 min;95℃变性20 s，60℃退火20 s;72℃延伸20 s，40个循环。定量检测引物见表1。

1.3 基因敲除和回补载体的构建

敲除载体构建及转化：根据VdPL14基因的侧翼序列分别设计上、下游片段扩增引物（表2），并以Vd991基因组DNA为模板扩增获得分别约1 kb的上、下游片段。使用EcoRⅠ对敲除载体pGKO2Hyg进行酶切得到线性载体，利用同源重组法将VdPL14基因的上游片段克隆至pGKO2Hyg上，并转入DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR验证，选取阳性菌落扩繁并提取质粒。利用XbaⅠ对连接上游片段的重组质粒进行酶切得到线性质粒，通过同源重组法将下游片段克隆至含上游片段的重组质粒上，转化大肠杆菌DH5α，PCR验证得到阳性菌落。将得到的重组质粒pGKO2VdPL14upHygVdPL14down转入农杆菌AGL1中备用。上、下游片段扩增条件：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，58℃退火30 s;72℃延伸1 min 10 s，28个循环;72℃延伸10 min。

回补载体构建及转化：以Vd991基因组DNA为模板，采用ECVdPL14F/R引物（表2）扩增VdPL14基因的全长序列（包含启动区、基因序列及终止区），利用EcoRⅠ和XbaⅠ对pCOM质粒（含遗传霉素抗性标记基因）进行线性化，通过同源重组技术将VdPL14基因全长序列克隆至pCOM载体上，转入DH5α感受态细胞并对单菌落进行PCR验证，将阳性重组质粒转入农杆菌AGL1备用。扩增条件：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，58℃退火30 s;72℃延伸3 min，28个循环;72℃延伸10 min。

1.4 农杆菌介导的大丽轮枝菌遗传转化及阳性转化子筛选

农杆菌的制备：将含有重组质粒（基因敲除载体或回补载体）的农杆菌接种于10 mL MM培养基中，28℃ 200 r/min振荡培养2 d，离心5 min弃上清，用IM培养基重悬，重复上述操作两次后用1 mL IM培养基（含200 μg/mL乙酰丁香酮）重悬菌体，稀释至OD600为0.15～0.20，于28℃，200 r/min振荡培养。待菌液OD600为0.5～0.7时取出备用。

大丽轮枝菌孢子悬浮液的准备：经活化的大丽轮枝菌野生型菌株Vd991于25℃培养7 d后切小块菌饼置于CM培养基中振荡培养3 d，收集孢子，将孢子浓度调至5×106个/mL备用。

共培养：将上述制备好的农杆菌与Vd991孢子悬浮液按1∶1（V/V）比例混匀，取100 μL涂布于IM平板（含200 μg/ml乙酰丁香酮）中的微孔滤膜上，25℃恒温暗培养2 d后将微孔滤膜转移至含有抗生素的PDA平板（含200 μg/mL头孢霉素;30 mg/mL潮霉素;100 μg/mL卡那霉素;50 μmol/L的F2dU）上培养7 d左右，挑取单菌落在上述PDA平板上连续进行3代单孢分离，分别利用基因内部检测引物（VdPL14InF/R）、潮霉素抗性基因检测引物（HygF/R）及基因侧翼外部引物（VdPL14OutF/R）进行PCR，筛选敲除突变体阳性转化子。

利用基因内部检测引物（VdPL14InF/R）和遗传霉素抗性基因检测引物（G418testF/R）进行PCR，筛选回补转化子。

所需引物见表3。

1.5 VdPL14敲除突变体及回补转化株碳源利用测定

野生型菌株Vd991、敲除突变体ΔVdPL14及回补菌株ECVdPL14分别于CM培养基中振荡培养4 d，制备成5×106个/mL孢子悬浮液。吸取1 μL孢子悬浮液接种在不同碳源培养基（果胶、羧甲基纤维素、淀粉、蔗糖）平板中央，置于25℃培养箱中黑暗倒置培养。在接种后第7天测量各菌株在不同碳源培养基上的菌落直径，拍照记录生长表型。

1.6 VdPL14敲除突变体生长表型及产孢量测定

以野生型菌株Vd991为对照，制备野生型和敲除突变体ΔVdPL14的孢子悬浮液（1×106个/mL）;吸取1 μL孢子悬浮液，滴到直径60 mm的PDA平板中心部位，25℃，恒温黑暗培养8 d后观察生长表型;光学生物显微镜下观察孢子形态;在菌落边缘处用内径8 mm的打孔器均匀取3个菌饼，放入3 mL无菌水中振荡混匀，利用血球计数板在显微镜下观察并统计孢子的数量，分析VdPL14敲除对产孢是否有影响（结果部分使用对数值体现）。

1.7 VdPL14敲除突变体及回补转化株致病性鉴定

棉花和烟草幼苗在25℃，L∥D=14 h∥10 h条件下分别培养约3周和4周用于接种。棉苗第2片真叶伸展时

采用蘸根法［19］进行接种。将棉花幼苗连根拔出，在5×106个/mL的大丽轮枝菌孢子悬浮液（Vd991、ΔVdPL14和ECVdPL14）中浸泡30 min后重新种回土中。烟苗采用灌根法接种，每盆浇灌15 mL 5×106个/mL的大丽轮枝菌孢子悬浮液。

每个突变体转化株系和野生型菌株均接种20株棉花和4株烟草幼苗，试验重复3次。

接菌21 d后观察棉花和烟草幼苗的发病情况并剖茎观察纵切面的病变情况，统计不同发病等级幼苗数量的占比，发病等级参照Zhang等［20］的分级方法。以烟草NbEF1α、棉花18S rDNA为内参基因，大丽轮枝菌的延伸因子VdEF1α作为靶标基因［18］（引物见表4），利用定量PCR（qPCR）法检测病原菌在棉苗或烟草茎基部的定殖情况（即生物量）。反应条件：95℃预变性3 min;95℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环。反应体系（20 μL）： DNA模板1 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，2×qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7.8 μL。

1.8 酵母信号肽活性检测方法

根据预测分析的信号肽序列长度（18个氨基酸），扩增编码信号肽的CDS序列（引物见表5）。利用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ将质粒pSUC2线性化，通过同源重组技术将目的片段克隆至pSUC2载体上，获得重组质粒pSUC2∷SPVdPL14并导入酵母菌株YTK12。将酵母菌株YTK12、YTK12pSUC2、YTK12SPVdPL14及阳性对照YTK12SPAvr1b分别划线于YPRAA（棉子糖为唯一碳源）和CMDW（色氨酸缺陷）培养基平板上，于30℃培养2 d后观察各酵母菌株的生长情况。

1.9 数据分析

利用Microsoft Excel的数据分析模块对试验数据进行t测验，采用Microsoft Excel和AdobePhotoshop CC作图。

2 结果与分析

2.1 PL1家族基本信息

基于基因组注释分析，大丽轮枝菌Vd991的基

因组共编码17个PL1家族基因，命名为VdPL11

～VdPL117。利用SignalP 5.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP5.0）对PL1家族成员进行信号肽预测分析，结果显示其中16个成员含有信号肽（表6，图1）;该家族成员多数

含有Amb_all结构域，另外VdPL17含有真菌

纤维素结合域（fungaltype cellulosebinding domain，FCBD），VdPL117含有碳水化合物结合模块结构域（carbohydratebinding module 1，

CBM1）（表6，图1）。利用MEGA 6构建大丽轮枝菌17个PL1家族成员及部分真菌的PL1家族蛋白的系统进化树，以阿维链霉菌Streptomyces avermitilis果胶裂解酶FoPEL（BAC74094）、芽胞杆菌Bacillus spp.果胶裂解酶BsPEL（1EE6_A）和稻瘟菌Magnaporthe oryzae果胶裂解酶CoPEL（XP_369589.1）蛋白序列作為外群。结果显示大丽轮枝菌Vd991中17个PL1家族成员被分成3个进化分支，其中VdPL12、VdPL14、VdPL15、VdPL16、VdPL18、VdPL110、VdPL111、VdPL114、VdPL116和VdPL117属于一个进化分支，包含的成员最多;VdPL17、VdPL19、VdPL112、VdPL113和VdPL115属于第二个进化分支，VdPL11和VdPL13属于一个进化分支。以上结果表明大丽轮枝菌中PL1家族成员在进化过程中发生了明显分化（图2）。

2.2 PL1家族基因表达模式分析

为明确PL1家族基因在大丽轮枝菌侵染棉花过程中的表达特性，测定了该家族基因在棉花根系诱导下在不同时间的表达差异情况，结果显示，除VdPL110、VdPL116和VdPL117在侵染过程中下调表达外，其余基因在侵染过程中均上调表达。其中，VdPL14、VdPL15和VdPL18在侵染的整个进程中显著上调表达（单因素方差分析P<0.001），初步表明这些基因在大丽轮枝菌的侵染过程中发挥重要作用。而VdPL14、VdPL18在侵染第2天时受诱导表达最为强烈，分别上调326.12倍和426.43倍，表明二者在侵染早期，尤其是突破寄主根部的表皮和皮层屏障时发挥重要作用。后续选取代表基因VdPL14进行其致病功能研究。

2.3 VdPL14基因敲除突变体和回补转化株PCR鉴定结果

VdPL14基因敲除转化菌株经单孢分离和纯化之后，选取2个转化子提取基因组DNA进行分子验证，结果如图4a所示：以野生型Vd991基因组为对照，潮霉素抗性基因检测引物（表3）从ΔVdPL14突变体中扩增到了约500 bp的条带，从野生型菌株Vd991中未扩增出条带;VdPL14基因内部检测引物（表3）从ΔVdPL14突变体中未扩增处条带，从野生型菌株Vd991中扩增到了约700 bp的条带;VdPL14基因外部检测引物（表3）从ΔVdPL14突变体中扩增到了约3 800 bp的条带，从野生型菌株Vd991中未扩增出条带（图4a）。以上结果表明潮霉素抗性基因已成功替换目的基因并整合到大丽轮枝菌基因组中，获得VdPL14缺失突变体ΔVdPL14。将上述转化子命名为ΔVdPL14#1和ΔVdPL14#2。

在ΔVdPL14#1、ΔVdPL14#2缺失突变体的基础上，构建了VdPL14基因回补菌株，利用基因内部引物及遗传霉素（G418）抗性基因引物（表3）进行分子验证，结果显示，回补转化株ECVdPL14与在野生型菌株中扩增到的VdPL14基因条带大小一致（约700 bp），且能成功扩增到遗传霉素抗性基因片段，表明成功构建了大丽轮枝菌VdPL14基因回补转化株的阳性转化子（图4b）。

2.4 VdPL14基因敲除突变体和回补转化株碳源利用分析

大丽轮枝菌在侵染植物过程中会分泌大量的植物细胞壁水解酶以降解植物细胞壁组织。植物细胞壁中主要含有果胶、纤维素、半纤维素等成分，为了明确VdPL14敲除突变体及回补转化株对不同植物碳源的利用能力，本研究分别测定了在4种不同碳源（蔗糖、果胶、羧甲基纤维素、淀粉）培养条件下敲除突变体和回补转化株的生长表型。结果表明，培养7 d后，相较于野生型菌株Vd991，敲除突变体ΔVdPL14#1和ΔVdPL14#2在以果胶、羧甲基纤维素和淀粉为唯一碳源的多糖培养基上的生长受到显著抑制，回补转化株的生长表型恢复到野生型的生长水平（图5）。上述结果说明基因VdPL14的缺失影响了大丽轮枝菌对果胶、羧甲基纤维素和淀粉的利用能力。

2.5 VdPL14基因敲除突变体及回补转化株生长表型及产孢量分析

PDA平板上的生长表型及显微形态观察结果表明，相较于野生型菌株Vd991，VdPL14基因缺失后菌落形态和孢子的显微形态没有显著差异（图6a）。产孢量的差异分析结果显示，缺失突变体ΔVdPL14#1和ΔVdPL14#2的产孢能力相对于野生型Vd991没有显著差异（图6b，6c）。以上结果说明，VdPL14基因的缺失对生长表型、孢子形态及产孢量均无显著影响。

2.6 VdPL14基因敲除突变体及回补转化株致病力分析

为验证突变体ΔVdPL14的致病力，分别将野生型菌株Vd991、突变体ΔVdPL14、回补转化株ECVdPL14接种感病品种‘军棉1号。结果发现，Vd991侵染的棉花表现出典型的黄化萎蔫症状，顶梢枯死，剖茎维管束褐化严重（图7a）。相较野生型，突变体ΔVdPL14对寄主棉花的致病力显著下降，仅极少数子叶表现出轻微黄化症状，维管束褐化明显减弱（图7a）。而接种回补转化子后棉花叶片恢复典型的黄萎症状，与野生型菌株类似（图7a）。烟草（本氏烟Nicotiana benthamiana）接种Vd991、ΔVdPL14、和ECVdPL14后情况与接种棉花的致病情况类似（图7b）。棉苗的发病情况统计（图7c）和大丽轮枝菌在根部的生物量与上述表型相对应（图7d）。接种烟草也得到了类似结果（图7e）。以上结果表明，VdPL14是大丽轮枝菌重要的毒力因子。

2.7 VdPL14信号肽分泌特性分析

本试验采用酵母信号肽捕获系统验证VdPL14信号肽是否具有介导蛋白分泌的功能。结果显示，不含pSUC2的YTK12菌株在CMDW培养基（色氨酸缺失培养基）和YPRAA培养基（以棉籽糖作为唯一碳源）上略有生长;携带pSUC2的YTK12菌株只能在CMDW培養基上生长，不能在YPRAA培养基上生长;阳性对照YTK12SPAvrb菌株具有信号肽活性，在CMDW和YPRAA培养基上均能生长;含有重组质粒的YTK12SPVdPL14酵母菌株在CMDW和YPRAA培养基上也均能生长（图8）。TTC试验（又称氯化三苯四氮唑法）表明，阳性对照YTK12SPAvrb和 YTK12SPVdPL14均可将蔗糖转移酶分泌出去，单糖还原TTC后呈红色，而不含pSUC2的YTK12菌株和携带pSUC2的YTK12菌株不能将蔗糖转移酶分泌出去，所以均为无色。上述结果表明VdPL14 N端信号肽具有介导蛋白外泌的活性，VdPL14为分泌蛋白。

3 结论与讨论

果胶是植物细胞壁最主要和最复杂的组分之一，微生物侵染植物必须突破该屏障。果胶裂解酶在突破寄主植物屏障中发挥重要作用。许多病原真菌中果胶裂解酶家族基因数量相较于非致病真菌显著增加［2124］。大丽轮枝菌是典型的土传维管束病原真菌，其通过根部侵染寄主，然后在导管中定殖和扩繁［13］。比较基因组分析也证实，相较其他叶部病原真菌（如稻瘟菌），大丽轮枝菌编码的碳水化合物活性酶更多，尤其是果胶酶，以适应其定殖在植物导管这一特殊生态位［14］。大丽轮枝菌果胶裂解酶PL1家族成员在大丽轮枝菌所有果胶裂解酶中丰度最高［14］，包含17个成员，部分家族成员在寄主诱导条件下表现为高表达，表明该家族成员在病原菌侵染寄主过程中发挥重要作用。序列进化分析也表明，该家族成员在进化过程中发生了显著分化，表明该家族成员在侵染过程中的功能也产生了一定程度的分化。通過对大丽轮枝菌PL1家族基因的系统分析，可为后续开展该家族成员致病功能和操纵免疫特性的鉴定提供重要数据支撑。

随着细菌中首个果胶裂解酶于1962年在软腐病菌Erwinia carotovora中被发现以来［25］，越来越多的果胶裂解酶被发现在病原菌致病过程中发挥重要作用。早期研究发现，腐皮镰孢豌豆专化型Fusarium solani f.sp. pisi的果胶裂解酶与其侵染直接相关，其中PLA基因在侵染寄主中高效表达，为关键致病靶标基因［2627］;在黑曲霉Aspergillus nidulans的6个PL基因中，PLA具有致病功能［28］;胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides中两个pel基因在引起寄主坏死中发挥作用［29］;大丽轮枝菌果胶裂解酶基因VdPEL1参与病原菌致病过程［17］;新近研究发现稻瘟菌中的果胶裂解酶基因MoPL1在侵染后期显著上调表达，在死体营养阶段发挥重要功能［30］。本研究通过对大丽轮枝菌侵染过程中高表达的果胶裂解酶基因VdPL14进行基因敲除和回补，并对突变体及回补转化株进行了致病性验证，明确了在侵染早期（48 h）显著上调表达的大丽轮枝菌果胶裂解酶基因VdPL14是重要的毒力因子，在其致病过程中发挥重要作用。该基因缺失后导致大丽轮枝菌对多种植物细胞壁复杂组分的降解和利用能力显著降低。

有研究发现果胶裂解酶家族成员能够作为病原体相关的分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）或损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）在病原菌侵染寄主过程中发挥操控寄主免疫的功能。例如，稻瘟菌中的果胶裂解酶MoPL1能够作为DAMPs激发烟草叶片的免疫反应［30］，大丽轮枝菌果胶裂解酶VdPEL1作为PAMPs激发的免疫反应（PAMPtriggered immunity，PTI）［17］，MoPL1和VdPEL1激发的寄主免疫反应均依赖于其自身的酶活。本研究虽然尚未开展该家族成员操控寄主免疫反应的系统分析，但是初步明确了VdPL14分泌到胞外发挥作用并且是重要的毒力因子。因此，推测VdPL14除了能够作为果胶裂解酶直接参与植物细胞壁组分的降解外，还有可能作为PAMP或DAMP在干扰植物免疫反应中发挥重要作用，但需要开展进一步的研究。

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（責任编辑：杨明丽）