蛋白激酶TaPiPK1在小麦抗条锈病反应中的功能分析

冯柃杰 张玲玉 王晓东 翟彤 甘鹏飞 汤春蕾 康振生 王晓杰

摘要

由條形柄锈菌小麦专化型Puccinia striiformis f. sp. tritici （Pst）引起的条锈病，长期严重威胁小麦安全生产。Pst通过毒性变异产生新毒性小种或致病类型，能克服生产上已应用的抗病基因，导致抗病品种感病。因此，挖掘抗条锈病基因资源对小麦抗病遗传改良和加快抗病新品种培育具有重要意义。蛋白激酶在应答病原菌侵染，传递植物免疫信号中发挥重要作用。本研究通过小麦转录组数据分析，筛选到参与应答Pst、小麦白粉菌Blumeria graminis f. sp. tritici和赤霉病菌Fusarium graminearum侵染的蛋白激酶基因TaPiPK1。该蛋白激酶基因编码551个氨基酸，C末端含有一个STK激酶结构域。利用RTqPCR检测发现，TaPiPK1在小麦与条锈菌非亲和互作的前期上调表达;TaPiPK1主要定位于细胞质与细胞膜。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术（BSMVVIGS）瞬时沉默TaPiPK1，显著降低小麦‘水源11对条锈菌非亲和小种CYR23的抗性，表明TaPiPK1参与小麦抗条锈病反应并发挥重要作用。因此，TaPiPK1有可能作为潜在的基因资源用于小麦抗条锈病育种。

关键词

小麦; 条锈病; 蛋白激酶; 病毒诱导的基因沉默; 广谱抗性

中图分类号：

S 435.121.42

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022172

Functional analysis of protein kinase TaPiPK1 in wheat resistance response to stripe rust

FENG Lingjie#， ZHANG Lingyu#， WANG Xiaodong， ZHAI Tong， GAN Pengfei，

TANG Chunlei， KANG Zhensheng， WANG Xiaojie*

（Sate Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas，College of Plant Protection， Northwest A & F University， Yangling 712100， China）

Abstract

Wheat stripe rust， caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici （Pst）， is a serious threat to wheat production. Pst frequently produces new virulent races or pathogenic types overcoming the diseaseresistant genes applied in wheat production through frequent virulence variation， subsequently leading to the susceptibility of resistant varieties to diseases. Therefore， excavating genetic resources of resistance is of great significance for the genetic improvement of wheat disease resistance and accelerating diseaseresistance breeding. Protein kinases play an important role in the transmission of plant immune signals in response to pathogen infection. In this study， a protein kinase gene TaPiPK1 involved in response to Pst， Blumeria graminis f. sp. tritici and Fusarium graminearum was identified by analyzing wheat transcriptome data. TaPiPK1 encoded 551 amino acids， and contained a serinethreonine kinase domain at Cterminal. RTqPCR results showed that the expression of TaPiPK1 was upregulated in the early stage of incompatible interaction between wheat and Pst. Subcellular localization revealed that TaPiPK1 was mainly localized in cytoplasm and cell membrane. Transient silencing of TaPiPK1 by barley stripe mosaic virusmediated gene silencing technique （BSMVVIGS） significantly reduced the resistance of wheat ‘Suwon 11 to Pst CYR23， indicating that TaPiPK1 plays an important role in wheat stripe rust resistance. Therefore， TaPiPK1 may be a potentially important gene resource for breeding for stripe rust resistance in wheat.

Key words

wheat; stripe rust; protein kinase; VIGS; broadspectrum resistance

条锈病是我国小麦生产上的主要病害之一，其病原菌是条形柄锈菌小麦专化型Puccinia striiformis f. sp. tritici （Pst）［1］。病原菌夏孢子能够随气流远距离传播，危害范围广，造成小麦5%～25%产量损失，对我国粮食安全构成严重威胁［2］。种植抗条锈病品种是最经济有效的病害防控策略。然而，条锈菌群体频繁发生毒性变异导致小麦品种丧失抗病性［23］。挖掘抗病新基因资源对于小麦条锈病的可持续防控具有重要意义。

蛋白激酶超家族主要由丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶和酪氨酸特异性蛋白激酶组成，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是生物体中重要的蛋白激酶家族，参与植物体内蛋白磷酸化，在信号传递中起着重要作用［4］。据研究，玉米［56］、水稻［7］、大豆［8］以及小麦［910］等多种植物的蛋白激酶参与干旱、盐及生物胁迫反应等多种信号传递途径。小麦基因组编码超过4 000个蛋白激酶基因，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、类受体激酶（RLK）、细胞质受体类激酶（RLCK）等多种类型，在调控小麦生长发育及应答各种环境胁迫中发挥着重要作用［11］。MAPK含有典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，其级联反应是高度保守的信号传导模块，参与调节植物生长发育及应对生物及非生物胁迫［12］。另外，一些抗病基因如水稻抗白叶枯病基因Xa21［13］、小麦抗叶锈病基因Lr10［14］、大麦抗杆锈病基因Rpg1［15］和番茄抗细菌性斑点病基因Pto［16］编码的抗病蛋白都含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，属于类受体激酶，在植物抗病反应中发挥重要作用。

本研究通过分析小麦与条锈菌互作过程的转录组数据，筛选到受条锈菌侵染诱导上调表达的蛋白激酶基因TaPiPK1。利用RTqPCR分析了TaPiPK1在小麥条锈菌互作过程中的表达特征，并利用VIGS技术分析了TaPiPK1在小麦抗条锈菌反应中的功能，以期为小麦抗病遗传改良提供新基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料及培养条件：小麦品种‘水源11，培养温度为16～20℃;本氏烟Nicotiana benthamiana，培养温度为25～28℃。光周期L∥D=16 h∥8 h。

菌株材料：小麦条锈菌小种条中23号（CYR23），工程菌株大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101。

质粒载体： pCAMBIA1302用于亚细胞定位表达载体构建;课题组保存的大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus， BSMV）BSMV∶α、BSMV∶β、BSMV∶γ载体，用于VIGS瞬时沉默试验。

1.2 试验方法

1.2.1 TaPiPK1克隆及序列分析

通过NCBI数据库（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST工具比对得到TaPiPK1全长序列。利用Primer Premier 5.0设计TaPiPK1扩增引物（TaPiPK1F和TaPiPK1R，序列见表1）并由北京擎科生物公司合成，以‘水源11总cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增程序为：98℃ 5 min;98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃ 10 min。回收目的片段并测序。利用NCBI数据库和Ensembl（https：∥plants.ensembl.org/Multi/Tools/Blast）在线数据库对测序序列进行比对进行分析。使用WheatOmics 1.0（http：∥wheatomics.sdau.edu.cn/expression/index.html）

的转录组数据分析了

TaPiPK1在病原菌诱导和高温等胁迫下的基因表达情况。利用DeePLoc 2.0、CBSTMHMM和CBSsignal等在线工具预测TaPiPK1的亚细胞定位、跨膜结构域及信号肽等信息。

1.2.2 TaPiPK1表达模式分析

分析TaPiPK1特异性序列，设计引物（TaPiPK1qRTF和TaPiPK1qRTR）;以小麦延伸因子TaEF1α基因为内参基因［17］，以接种条锈菌CYR23后不同时间点制备的小麦叶片cDNA为模板，使用Vazyme公司的染料法荧光定量Mix，进行qPCR扩增。反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，TaPiPK1qRTF（10 μmol/L）0.4 μL，TaPiPK1qRTR（10 μmol/L）0.4 μL，小麦各时间点cDNA 2 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序为：95℃ 30 s;90℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环;95℃ 10 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。每个处理样本进行３次重复，确定溶解曲线和荧光变化曲线正常，利用2-ΔΔCt法计算不同时间点目的基因的相对表达量［18］。

1.2.3 TaPiPK1亚细胞定位

根据TaPiPK1的CDS序列（去终止子）设计引物（TaPiPK1pCAMBIA1302F和TaPiPK1pCAMBIA1302R），PCR扩增获得的基因片段连接到携带GFP标签的pCAMBIA1302载体上，构建TaPiPK1∶GFP融合表达载体。将融合表达载体转入农杆菌GV3101感受态细胞中，扩大培养阳性克隆，4 000 r/min离心收集菌体，利用10 mmol/L的MgCl2溶液清洗3次，用乙酰丁香酮缓冲液［含10 mmol/L MgCl2，10 μmol/L 乙酰丁香酮（AS），10 mmol/L 2（N吗啡啉）乙磺酸（MES），pH 5.6］重悬菌体并稀释至OD600=0.3，置于黑暗条件下1 h，用于烟草注射。选取生长3～4周的本生烟叶片进行农杆菌注射。注射48 h后，在激光共聚焦显微镜（Olympus FV3000）下观察融合蛋白表达情况及其在细胞内的分布。用液氮将观察到荧光的烟草叶片研磨成粉状，使用Beyotime公司的植物Western及IP细胞裂解液试剂盒提取烟草叶片蛋白，进行Western blot检测。

1.2.4 大麦条形花叶病毒介导的TaPiPK1基因沉默

大麦条形花叶病毒（BSMV）介导的VIGS技术已被广泛应用于小麦基因功能研究，该技术体系包含BSMV∶α、BSMV∶β和BSMV∶γ 3个载体。将100～300 bp的靶标片段连接到BSMV∶γ载体上，通过与BSMV∶α、BSMV∶β进行病毒重组可以有效地将靶标基因瞬时沉默［19］。本研究利用NCBI的 Blastn工具分析TaPiPK1的同源序列并选取TaPiPK1特有的300 bp 核苷酸片段，设计引物（TaPiPK1γF和TaPiPK1γR，序列见表1）扩增并回收扩增片段。利用一步克隆法将目的片段构建至经PacⅠ和NotⅠ双酶切的BSMV∶γ载体上，得到BSMV∶γTaPiPK1质粒。利用BssHⅡ对BSMV∶γTaPiPK1、BSMV∶γPDS质粒进行酶切线性化;利用Mlu I对BSMV∶α、BSMV∶γ质粒进行酶切线性化;利用SpeI对BSMV∶β质粒进行酶切线性化。以相同浓度的线性化产物为模板，利用RiboMAXTM Large Scale RNA Production SystemsT7试剂盒（Promega，美国）进行体外转录，凝胶电泳检测后，剩余产物用DEPC水稀释备用。

取体外转录好的BSMV∶α、BSMV∶β各0.5 μL分别与0.5 μL的BSMV∶γPDS、BSMV∶γ和BSMV∶γTaPiPK1按1∶1∶1的体积比混合，再加入FES buffer（2.613 g磷酸氢二钾，1.877 g甘氨酸，0.5 g焦磷酸钠，0.5 g硅藻土，0.5 g 斑脱土，定容至50 mL高温蒸汽灭菌后使用）混匀。将小麦品种‘水源11在16℃条件下培养至两叶一心期。通过涂抹的方式将重组病毒接种到小麦的第二叶。八氢番茄红素脱氢酶基因PDS是叶绿素合成中的重要基因，缺失后会导致植物出现光漂白现象，试验中将单独涂抹FES buffer的植物作为阴性对照，将接种BSMV∶γPDS的植株作为病毒接种的阳性对照，以判断病毒接种是否成功［20］。接种2周后观察到接种BSMV∶γPDS的小麦植株第3叶出现光漂白现象后，将接种BSMV∶γTaPiPK1和空载体对照（BSMV∶γ）的植株第4叶分别接种条锈菌CYR23，在0、24、48、120 h后分别取接种条锈菌的叶片作为样本，用于组织学观察和基因表达分析。接种14 d后观察表型，统计发病情况。利用WGAAlex 488荧光染料对叶片中的条锈菌菌丝进行染色，在荧光显微镜下观察、统计菌丝的发育情况［17］。

2 结果与分析

2.1 TaPiPK基因的克隆和序列分析

TaPiPK1的CDS序列包含1 656个碱基，编码551个氨基酸，含有保守的STK激酶结构域，无信号肽和跨膜区域，预测TaPiPK1定位于细胞质中。利用WheatOmics 1.0对TaPiPK1在多种胁迫下转录组数据进行分析［2124］，结果表明TaPiPK1（Ensemble plant中的登录号为TraesCS7B02G255500）的表达受Pst、赤霉菌Fusarium graminearum和白粉菌Blumeria graminis f. sp. tritici等病菌的诱导，同时也受干旱、高盐、高温等非生物胁迫的诱导（图1）。

2.2 TaPiPK1在条锈菌侵染过程中的表达特征

RTqPCR结果显示，在条锈菌与小麦的非亲和互作中，TaPiPK1主要在病原菌侵染后12、24 h和48 h表达，在接种后12 h相对表达量约为0 h的5倍，達到表达量的峰值（图2）。推测TaPiPK1可能在小麦应答条锈菌侵染早期发挥作用。

2.3 瞬时沉默TaPiPK1减弱了小麦对条锈菌的抗性

接种病毒后10～12 d，接种BSMV∶γPDS的小麦植株出现光漂白现象，接种BSMV∶γTaPiPK1、BSMV∶γ的植株均出现明显的病毒症状，表明病毒接种成功 （图3a）。接种条锈菌CYR23后14 d，发现接种BSMV∶γ的叶片出现典型的

过敏性坏死反应，无夏孢子堆，而沉默TaPiPK1的植株产生了少量夏孢子堆（图3b）。

利用RTqPCR技术分别对条锈菌侵染24、48 h和120 h后

TaPiPK1的表达量进行检测发现，与接种BSMV∶γ植株相比，接种BSMV∶γTaPiPK1植株中TaPiPK1的表达量显著降低，在24、48 h和120 h分别减少58.1%、61.4%、45.3%，表明TaPiPK1被有效沉默（图3c）。以上结果表明沉默TaPiPK1减弱了小麦的抗病性，正调控小麦抗条锈菌反应。

2.4 沉默TaPiPK1促进了条锈菌在小麦叶片中的发育

利用组织学观察条锈菌菌丝生长发育情况，发现在24 h和48 h，TaPiPK1沉默叶片中条锈菌侵染菌丝长度显著大于对照，菌丝扩展面积也显著大于对照叶片（图4）。沉默TaPiPK1促进了小麦叶片中条锈菌的生长发育（图4）。

2.4 TaPiPK1亚细胞定位分析

为了探究TaPiPK1发挥作用的部位，利用农杆菌介导的瞬时表达技术将TaPiPK1∶GFP融合载体在烟草中瞬时表达，以只表达GFP的叶片为对照，显微镜观察发现TaPiPK1∶GFP绿色荧光主要分布于烟草细胞的细胞膜和细胞质（图5a）。 为了确定TaPiPK1∶GFP和GFP是否正确表达，提取对应烟草叶片总蛋白进行Western blot分析，结果分别检测到75 kD及25 kD的条带，与目的蛋白分子量一致，证明蛋白在烟草中正确表达（图5b）。

3 结论与讨论

在条锈菌侵染小麦过程中，夏孢子萌发形成的芽管侵入气孔，形成气孔下囊和初生菌丝，初生菌丝向叶肉细胞侵染形成吸器母细胞，在侵染12～24 h产生大量吸器［2526］。吸器是条锈菌从寄主吸取营养的特化结构，也是条锈菌向小麦分泌效应蛋白抑制小麦免疫的重要结构。因此，吸器形成的时期是决定条锈菌能否成功定殖的关键时期，也是小麦防卫反应最强烈的时期。在非亲和互作中，TaPiPK1在条锈菌侵入小麦12 h和24 h显著上调表达，表明TaPiPK1可能在这一关键时期发挥作用。

研究发现一些抗病基因具有激酶结构域，小麦抗条锈基因Yr36编码的抗病蛋白含有激酶结构域，在高温下介导对多个条锈菌系的广谱抗性［27］;小麦抗赤霉病基因WAK2编码一类细胞壁受体激酶，可以有效调控对于赤霉病的抗性［28］;小麦叶枯病抗病基因STB6 编码一个富含半胱氨酸的受体激酶，对携带AvrStb6基因的菌株具有基因对基因类型的抗性［29］。另外，一些类受体激酶或胞内蛋白激酶在调控小麦的抗病中也发挥重要作用［30］。TaCRK3是富含半胱氨酸类受体蛋白激

酶，通过基因沉默发现其具有抗真菌活性，并能够调控乙烯信号通路中防御相关基因表达从而介导小麦对禾谷镰孢Fusarium graminearum的抗性［31］。在小麦中TaRLCK1B属于第Ⅶ亚家族的类受体胞质激酶，正调控小麦对小麦纹枯病的抗性，在抗性品种中的表达水平显著高于感病品种［32］。在簇毛麦Dasypyrum villosum中鉴定到的RLKV蛋白激酶能够调节小麦对白粉病的基础抗性［33］。本研究通过基因沉默试验发现TaPiPK1正调控小麦对条锈病的抗性。小麦抗病基因STB6在叶枯病菌Zymoseptoria tritici诱导后24 h上调表达［29］，TaRLCK1B受小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis诱导后24 h和48 h上调表达［32］，与这两个基因类似，TaPiPK1在条锈菌侵染前期上调表达。另外，TaPiPK1与STB6、TaCRK3等抗病相关蛋白激酶均定位于细胞质和细胞膜，表明其发挥作用的位置是类似的。不同的是，转录组分析发现TaPiPK1响应条锈病、白粉病、赤霉病等多种病害以及干旱、高温、高盐等非生物胁迫，推测TaPiPK1可能在小麦应对生物胁迫、非生物胁迫中发挥一定的作用，有可能作为小麦遗传改良中兼具广谱抗病性及抗逆性的候选基因。

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