梨小食心虫气味受体GmolOR 10基因克隆及表达谱分析

陈秀琳 李琳琳 陈玉鑫 李广伟

摘要

为研究梨小食心虫Grapholita molesta Busck嗅觉通讯分子机制，本研究应用RTPCR克隆获得了梨小食心虫气味受体基因GmolOR10的完整開放阅读框，并对其序列结构进行了相关生物信息学分析，最后采用实时荧光定量PCR对GmolOR10在梨小食心虫成虫不同组织（触角、头、胸、腹、足、翅）与不同发育阶段的表达模式进行了定量分析。结果表明，GmolOR10编码区长1 194 bp，编码397个氨基酸，等电点和相对分子量分别为8.57和46.14 kD，有7个跨膜结构域。多序列比对与系统发育树结果显示GmolOR10与卷蛾科苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR18和山毛榉卷叶蛾Cydia fagiglandana CfagOR18的氨基酸序列一致性较高，分别为84.38%和83.38%。GmolOR10在雄成虫触角中表达量较高，极显著高于雌虫触角（P<0.01），在雌、雄成虫头部也有较高的表达量，在成虫其他组织表达量很低。不同发育阶段的表达谱显示，GmolOR10在梨小食心虫的不同发育阶段均有表达，在成虫期的表达量最高（在雌雄成虫中的表达量均呈现出随着日龄增加逐渐升高然后下降的趋势），在其他发育阶段的表达量相对较低。GmolOR10具有昆虫气味受体的结构特征，在雌、雄虫触角高表达，在各发育阶段均有表达，据此推测GmolOR10可能与梨小食心虫觅食、感受及识别性信息素的过程有关。

关键词

梨小食心虫; 气味受体10; 基因克隆; 实时定量PCR; 表达模式

中图分类号：

S 433

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022099

Cloning and expression profiling of odorant receptor gene GmolOR10 in Grapholita molesta Busck

CHEN Xiulin*， LI Linlin， CHEN Yuxin， LI Guangwei

（College of Life Science， Yanan University， Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube， Yanan 716000， China）

Abstract

In order to investigate the molecular mechanism of olfactory communication in Grapholita molesta Busck， GmolOR10 was cloned by RTPCR in this study. The sequence structure of GmolOR10 was analyzed by using bioinformatics software， and then its expression profiles in different adult tissues （antenna， head， thorax， abdomen， leg and wing） and at different developmental stages were measured by realtime quantitative PCR. The results revealed that the CDS of GmolOR10 was 1 194 bp in length， encoding 397 amino acid residues， with a predicted theoretical isoelectric point and a relative molecular mass of 8.57 and 46.14 kD， respectively， and seven transmembrane domains. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis indicated that GmolOR10 was closely related to the odorant receptor CpomOR18 from Cydia pomonella and CfagOR18 from Cydia fagiglandana， with an amino acid sequence identity of 84.38% and 83.38%， respectively. Tissuespecific expression profiling showed that abundant expression of GmolOR10 existed in the antenna of male， extremely higher than that in the antenna of female moth （P<0.01）. GmolOR10 also showed higher expression in the head of both sexes， and displayed low expression level in the other tissues. Developmental stagespecific expression profiling demonstrated that GmolOR10 was expressed at different developmental stages of G.molesta and the expression level of GmolOR10 at adult stage was higher （the expression levels in male and female moths increased first and then decreased with dayage）， and relatively lower expression was detected at other developmental stages. Based on the structural characteristics and the expression profiling results of GmolOR10， it is speculated that GmolOR10 may be involved in the process of foraging， feeling and recognition of sex pheromones in G.molesta.

Key words

Grapholita molesta; odorant receptor 10; gene cloning; realtime quantitative PCR; expression profile

梨小食心虫Grapholita molesta Busck隶属鳞翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae，是一类世界性的果树害虫，给果业生产造成严重损失。在国内，除西藏尚未见报道外，其在全国各地均有分布，尤其在北方桃、梨和苹果产区发生最为严重［1］。在国外，梨小食心虫除分布于亚洲许多国家之外，在欧洲、美洲、非洲北部、澳大利亚与新西兰也都有发现［23］。梨小食心虫有转主为害习性。春季和夏初主要在桃园蛀食果树新梢和果实，夏末和秋初转移至梨园或苹果园继续为害，在桃、梨或桃、苹果混栽林区，此种现象尤为严重［4］。目前，对梨小食心虫的防治仍以喷施化学农药为主［3］，鉴于其以幼虫蛀食为害，生活环境极其隐蔽，成虫跨园飞行能力极强等特征，化学防治效果往往不理想，而高剂量、高频次地喷洒农药势必引起环境污染、天敌数量锐减、害虫抗药性增强、果品农药残留及质量下降等一系列问题。因此亟须探索出一种高效、无公害的新方法防治该虫。

在长达几亿年的进化过程中，昆虫灵敏的嗅觉系统与其生存、繁衍息息相关［5］。昆虫通过复杂敏锐的嗅觉系统识别环境中的各类化学物质，将化学信号转换成电信号最终传递给脑部中枢神经系统指导昆虫做出相应的行为反应。许多与嗅觉有关的蛋白参与了昆虫对外界环境的识别过程，如化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、气味受体（odorant receptors，ORs）、离子型受体（ionotropic receptors，IRs）、气味降解酶（odorant degrading enzymes，ODEs）、感觉神经元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）和尼曼匹克C2型蛋白（NiemannPick type C2 protein，NPC2）等［67］。昆虫对外围环境的识别过程中，ORs发挥了核心作用［5，8］。昆虫的ORs是一种在嗅觉神经元（olfactory sensory neurons，OSNs）中表达的膜蛋白，具有7个跨膜结构域，其C端位于细胞膜外，N端在细胞内［5］。昆虫ORs可以分为两类：一类是非典型气味受体（typical odor receptor），也称作嗅觉受体共受体（odorant receptor coreceptor，Orco），一般情况下每种昆虫中只有一个Orco，在不同种类的昆虫中同源性非常高;另一类是典型气味受体（conventional odorant receptor，ORX），数量众多，在同种昆虫和不同种类昆虫中均高度分化［9］。研究表明Orco一般不单独与配体结合，而是与ORX形成异源二聚体在气味受体神经元（odorant receptor neurons，ORNs）树突膜上共表达，其主要功能是提高ORX对气味配体的结合能力和ORX在神经元树突上定位的准确性［10］。近年来，随着高通量测序的普及和分子生物学技术的飞速发展，已经从许多农林害虫如苹果蠹蛾 Cydia pomonella、桃小食心虫 Carposina sasakii、葡萄花翅小卷蛾 Lobesia botrana、苹浅褐卷蛾Epiphyas postvittana、歐洲玉米螟 Ostrinia nubilalis、棉铃虫 Helicoverpa armigera、星天牛Anoplophora chinensis、苹小吉丁Agrilus mali等200余种昆虫中鉴定到大量的ORs基因［1116］。

目前，对梨小食心虫嗅觉相关基因的研究主要集中在OBPs、CSPs、信息素结合蛋白（pheromone binding proteins，PBPs）与谷胱甘肽S转移酶（glutathione Stransferase，GSTs），通过雌虫触角转录组测序、基因克隆、组织表达谱和与寄主植物气味配体的结合试验，对相关基因的功能进行了研究［1719］。对梨小食心虫ORs基因的研究较少。开展对梨小食心虫气味受体的研究有助于了解其嗅觉识别特点，还可为科学防控该虫提供理论参考。前期通过对梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据进行分析，获得了GmolOR10的编码区（coding regions，CDS），本研究通过常规分子克隆方法获得了GmolOR10完整的开放阅读框（open reading frame，ORF），对其序列结构进行生物信息学分析，最后采用实时荧光定量PCR分析GmolOR10在梨小食心虫雌、雄成虫不同组织及不同发育阶段的表达模式，以期为将来更加深入研究该气味受体的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

2008年春末在陕西省杨凌示范区郊区桃园采集梨小食心虫幼虫，已在实验室人工喂养100多代，每年春末和夏初从桃园采集野生幼虫种群复壮。在人工气候培养箱中，幼虫用人工饲料和苹果混合喂养［20］，成虫用5%的白砂糖水或蜂蜜水喂养。饲养条件：温度（25±1）℃，相对湿度（65±5）%，光周期L∥D=15 h∥9 h。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂TRIzol、DNA 2000 Marker、10× Loading Buffer、克隆载体pMD19T、SYBR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time）购自TaKaRa公司;First Strand cDNA Synthesis Kit购自西安热默尔生物科技有限公司;高保真DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DH5α感受态细胞与琼脂糖DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;引物合成与测序均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.3 不同组织和不同发育阶段梨小食心虫总RNA提取及第一链cDNA的合成

收集3日龄梨小食心虫雌、雄成虫触角各200根，头（去掉触角）各50个、胸各10个、腹各5个、各100头虫的足、各100头虫的翅;卵约400粒、1龄和2龄幼虫各50头、3龄幼虫30头、4 龄幼虫10头、5龄幼虫5头、蛹2个、不同日龄（1、3、5、7日龄）的雌、雄成虫各2头。将以上样品分别置入1.5 mL无RNA酶离心管中，在液氮中速冻后保存在－80℃冰箱备用。上述的每个样品为1个生物学重复，设3个生物学重复。

参照TRIzol试剂盒说明，将上述样品在无RNA酶离心管内研磨后提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。核酸蛋白浓度测定仪（SimpliNano，GE）检测RNA质量和浓度，检测合格的样品用DNaseⅠ去除基因组DNA，然后参照反转录试剂盒说明书合成第一链cDNA，保存于－80℃冰箱备用。

1.4 引物设计与合成

根据梨小食心虫雌虫触角转录组数据获得GmolOR10序列［17］，使用Primer 6.0软件设计特异性引物，扩增该基因完整的开放阅读框;利用Primer 3在线软件（https：∥primer3.ut.ee/# PRIMER_SEQUENCE_INPUT） 设计实时荧光定量PCR引物（表1）。选用梨小食心虫的EF1α基因为内参基因（GenBank登录号： KT363835.1）［21］。

1.5 GmolOR10基因克隆、测序与鉴定

以梨小食心虫雌虫触角cDNA为模板（100 ng/μL），扩增GmolOR10的开放阅读框。PCR 扩增体系：DNA 聚合酶12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.5 μL，cDNA模板1.5 μL，ddH2O 8.0 μL，充分混勻、短暂离心。PCR反应条件：95℃ 5 min;95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 90 s，循环40次;72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶检测后纯化目的条带。将纯化后的PCR产物连接至克隆载体pMD19T，再转化到DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌液PCR检测后将阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行双向测序。

1.6 GmolOR10和其他昆虫相关序列的多序列比对与系统进化分析

通过在线软件ORF Finder （http：∥bioinf.ibun.unal.edu.co/servicios/sms/orf_find.html）预测梨小食心虫GmolOR10基因的开放阅读框，利用软件BioEdit将核酸序列翻译成氨基酸序列，用http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/预测GmolOR10的跨膜结构域和蛋白分子量。用在线软件https：∥web.expasy.org/compute_pi/预测理论等电点;使用软件DNAMAN对GmolOR10和其他昆虫的ORX氨基酸序列一致性进行分析，使用MEGA 6.0 软件中的邻接法（neighborjoining method）构建系统进化树（bootstrap： 1 000次）。

1.7 RTqPCR检测GmolOR10的相对表达量

以1.3中获得的cDNA（稀释至200 ng/μL）为模板，以梨小食心虫的延伸因子1α （GmolEF1α）为内参基因，利用相对定量法分析GmolOR10在成虫不同组织、不同发育阶段和成虫不同日龄的表达状况。反应在实时荧光定量PCR仪CFX96（BioRad）中进行。qPCR反应体系：cDNA模板2 μL，10 μmol/L的正、反向引物各1 μL，SYBRPremix Ex TaqTM 10 μL，DEPC水补足至20 μL，以加DEPC水为阴性对照组。qPCR反应程序：95℃ 30 s; 95℃ 10 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环;59～95℃记录熔解曲线。每个样品3个技术重复，用2－△△Ct法计算目的基因的相对表达量［22］。

1.8 数据统计与分析

利用SPSS 19.0软件对GmolOR10在成虫不同组织、不同发育阶段的表达差异进行单因素方差分析（Tukey检验），GmolOR10在雌雄成虫同一组织间的表达差异进行独立样本t测验（independent samples ttest），用GraphPad Prism 6.0软件绘制图。

2 结果与分析

2.1 GmolOR10基因的克隆和序列分析

通过基因克隆获得到梨小食心虫GmolOR10的完整编码区（GenBank登录号：URZ86304.1）。GmolOR10的开放阅读框（open reading frame，ORF）全长1 194 bp，编码397个氨基酸（图1），预测的蛋白等电点和分子量分别为8.57与46.14 kD。经TMHMM 2.0软件分析发现GmolOR10有7个α螺旋跨膜结构域（transmembrane domain），跨膜区分别位于第4－27、39－61、71－90、123－145、184－206、269－291、296－318氨基酸之間，该蛋白N端位于细胞内，C端位于细胞膜外（图1）。

2.2 GmolOR10与其他昆虫相关序列的多序列比对与系统进化分析

经BLAST同源搜索和序列比对发现，昆虫种间的ORX相对于Orco序列相似度较低。相对N端，GmolOR10与其他昆虫的ORX的C端保守性更高一些（图2）。GmolOR10与苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR18的氨基酸序列一致性最高，为84.38%;与山毛榉卷叶蛾 C.fagiglandana CfagOR18的氨基酸序列一致性也较高，为83.38%; 与棉铃虫H.armigera HarmOR10、二点委夜蛾Athetis lepigone AlepOR8 和烟草夜蛾Manduca sexta MsexOR31的氨基酸序列一致性较低，分别为76%，75%和74%。

系统进化树分析发现，所选择的昆虫ORs分化成了2个大的分支，即所有昆虫的嗅觉受体共

受体（Orco）聚于一个分支上，典型气味受体（ORX）聚到另一个大分支。GmolOR10与ORX聚为一支，并且与卷蛾科的苹果蠹蛾（CpomOR18）、山毛榉卷叶蛾（CfagOR18）、葡萄花翅小卷蛾 L. botrana （LbotOR18）等鳞翅目卷蛾科昆虫的ORX聚到了一小分支，说明它们的遗传距离近，一致性相对较高，亲缘关系更近，此结果与多序列比对结果一致（图3）。

2.3 GmolOR10的表达谱分析

以梨小食心虫雌虫足中的GmolOR10 mRNA表达量为基准，对其在不同组织中的mRNA表达量进行分析（图4）。结果表明，GmolOR10在雌雄虫不同组织中均有表达，其表达量表现出性别差异。GmolOR10在雄虫触角中的表达量最高，极显著高于雌虫触角中的表达量（P＜0.01），是其在雌虫触角中表达量的3倍;在雄虫头部（去除触角）表达量也较高，显著高于其在雌虫头部的表达量（P＜0.05），是其在雌虫头部表达量的2.2倍。GmolOR10在雌雄成虫的胸、腹、足和翅中的表达量很低，其中在雄虫腹、足、翅中的表达量均比雌虫高。

以梨小食心虫卵中的GmolOR10 mRNA含量为标准，对不同发育阶段的mRNA表达量进行分析。由结果（图5）可知，GmolOR10在梨小食心虫的不同发育阶段均有表达，在成虫阶段的表达量最高，其次是卵、1日龄蛹和5日龄蛹。GmolOR10在成虫阶段的表达量以3日龄最高，随后出现下降趋势;其在3日龄雄虫中的表达量是雌虫的1.62倍（P<0.05）;在1日龄和3日龄雄虫中的表达量也高于其在同日龄雌虫中的表达量，分别是雌虫中表达量的1.20倍和1.46倍;在幼虫期的表达量相对较低。

3 结论与讨论

灵敏的嗅觉系统在昆虫觅食、寻偶、定位产卵场所等生命活动过程中发挥着不可或缺的作用，嗅觉受体是昆虫触角外周嗅觉系统识别外界环境中气味分子的关键蛋白，它们的序列结构相似［17，34］。本研究基于梨小食心虫雌虫触角转录组数据，通过常规分子克隆方法获得了GmolOR10完整的开放阅读框，利用在线软件预测发现GmolOR10有7个跨膜结构域，其N端位于细胞膜内，C端位于细胞膜外，跨膜结构域的数量与拓扑结构均符合昆虫嗅觉受体的典型特征，这种结构与昆虫的传统气味受体可能具有4～8个跨膜结构域相一致［7，23］。多序列比对结果显示，相对于易变异的N端，C端比较保守，据此推测同源性较低的N端可能是不同昆虫ORX识别不同气味物质的缘由。梨小食心虫GmolOR10与

卷蛾科的苹果蠹蛾CpomOR18和葡萄花翅小卷蛾LbotOR18的序列一致性较高，可能是直系同源基因。系统进化树结果显示GmolOR10与卷蛾科的一些昆虫的典型气味受体聚集为一个小的分支，说明GmolOR10是典型气味受体，且与卷蛾科昆虫的亲缘关系较近，进一步证实昆虫的嗅觉受体虽然经历了长达几亿年漫长的进化，但同科昆虫的ORX聚在了一个分支，此结果与分类的结果一致。

在鳞翅目昆虫中，不同的OR基因在表达模式上存在差异，表达模式与其功能紧密相关［2425］。如家蚕Bombyx mori BmorOR19与甜菜夜蛾Spodoptera exigua SexiOR18主要在雌雄虫触角中表达，在雌虫触角中的表达量显著高于雄虫，在其他组织中表达量低或不表达，推测其主要参与了雌虫寻找产卵场所的特异性行为［2627］。小菜蛾Plutella xylostella PxylOR16、PxylOR17、PxylOR18和斜纹夜蛾Spodoptera litura SlituOR12均在雌雄虫触角中大量表达，但差异不显著，在其他组织如头、腹部也有一定的表达，推测其可能参与了雌雄虫的共同生命活动过程如定位寄主植物和取食等［2829］。除此以外，棉铃虫H.armigera HarmOR3、HarmOR13与烟青虫Helicoverpa assulta HassOR11在雄虫触角中大量表达，其表达量显著高于在雌虫触角中的表达量，推测其可能涉及雄虫寻偶行为［30］。本研究获得的GmolOR10在雌雄成虫触角中表达量较高，在雄虫触角的表达量显著高于雌虫。此外，在雌雄虫头部也有一定的表达，推测其可能参与了雌、雄虫寻找和定位寄主植物的过程。

GmolOR10在雌雄成蟲期的表达量均呈现出随日龄增加先增加后减少的趋势，相同日龄下在雄虫中的表达量均高于雌虫。在3日龄雌雄成虫的中的表达量达到峰值，随后呈现逐渐降低趋势。说明成虫在羽化3 d后GmolOR10的表达量逐渐降低，此结果与中红侧沟茧蜂Microplitis mediator MmedOR2在雌、雄蜂羽化第3天表达量达到峰值随后降低，梨小食心虫G.molesta GmolOR20在3日龄成虫的表达量最高等结果［3132］相似。据报道梨小食心虫在羽化后3 d，其交配与产卵行为最为活跃［33］，说明3日龄是梨小食心虫成虫定位寄主植物、觅食、释放性信息素、寻偶、交配繁殖最为活跃的阶段，需要非常精确地辨析周围复杂环境中各种气味物质，而此时GmolOR10在雌雄虫中的表达量也达到峰值，意味着GmolOR10可能涉及雄虫感受性信息素、及雌雄虫觅食行为。

昆虫典型气味受体只在嗅觉神经元中有选择地表达［34］，表达丰度分析表明，大部分昆虫的ORX基因在各发育阶段中的每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片（fragments per kilobase million，FPKM）值都较低［35］，属于低表达基因。近年来对昆虫相关基因嗅觉的研究表明，气味受体亦在卵或者蛹中有较多的表达。沟眶象Eucryptorrhynchus scrobiculatus EscrOR50、臭椿沟眶象E.brandti EbraOR47和舞毒蛾Lymantria dispar LdisOR2在蛹期的表达量都较高，EbraOR46和LdisOR2在卵期拥有最高表达量［3536］，推测这些ORs可能在发育的早期阶段就已发挥功能。本研究中GmolOR10除在成虫期高表达外，在卵和蛹期也有表达。说明GmolOR10除了参与寻偶行为外，还可能参与成虫寻觅寄主植物和幼虫取食行为等相关生命活动过程。

本研究用常规克隆方法，获得GmolOR10完整的编码区，通过生物信息分析软件对其结构进行了初步分析，并利用定量的方法初步明确了此基因在梨小食心虫不同组织与不同发育阶段的表达模式，推测其可能参与了性信息素和寄主挥发物的识别过程。GmolOR10在梨小食心虫感受外界环境过程中识别何种气味物质，后期将通过RNA干扰、真核表达该基因后利用双电极电压钳试验等对其具体功能进行验证。本研究为将来研究梨小食心虫其他气味受体和进一步研究其蛋白嗅觉识别机制奠定了基础，为今后利用嗅觉受体作为分子靶标来干扰昆虫识别外界环境气味物质提供参考，以期达到无公害防治该虫的目的。

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（责任编辑：杨明丽）