磷酸二氢钾影响马铃薯对晚疫病抗性的初步研究

张哲 刘霞 王兴国 杨俐 陈丽 黄勋 张雅敏 杨艳丽

摘要

本研究以馬铃薯品种‘丽薯6号为试材，对叶面喷施不同浓度磷酸二氢钾4 d后的植株接种晚疫病菌，测定晚疫病发生的严重度，并测定磷酸二氢钾和晚疫病菌处理后14 d内马铃薯植株的PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量。结果表明，在一定浓度范围内，磷酸二氢钾可减轻马铃薯晚疫病的发生，随着施用浓度的增加，晚疫病发病逐渐减轻。其中磷酸二氢钾质量浓度为0.6%时，晚疫病发病最轻，接种晚疫病菌后8 d防效达35.64%，12 d时仍超过30%，但浓度超过0.6%，晚疫病发生加重。同时，喷施磷酸二氢钾可不同程度地提升健康和接种晚疫病菌的马铃薯植株体内6种防御酶活性及可溶性蛋白含量。因此，磷酸二氢钾在一定时间段内可诱导马铃薯对晚疫病的抗性，减轻晚疫病的发生。

关键词

磷酸二氢钾; 马铃薯晚疫病; 抗病性

中图分类号：

S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022070

A preliminary study on the effects of potassium dihydrogen phosphate on the resistance of potato to late blight

ZHANG Zhe1， LIU Xia1， WANG Xingguo1， YANG Li2， CHEN Li1，

HUANG Xun1， ZHANG Yamin1， YANG Yanli1*

（1. College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2. Dali Station of Plant Protection and Inspection， Yunnan Province， Dali 671000， China）

Abstract

The potato variety ‘Lishu no.6 was sprayed with different concentrations of potassium dihydrogen phosphate. Four days later， the plants were inoculated with Phytophthora infestans to determine the severity of potato late blight. The activities of PAL， SOD， POD， PPO， Chi， GLU and the contents of SP in potato plants were determined within 14 days after treatment. The results showed that potassium dihydrogen phosphate could reduce the occurrence of potato late blight. With increasing application concentrations， the occurrence of potato late blight gradually decreased， but when the concentration exceeded 0.6%， the occurrence of potato late blight became more serious. When the concentration of potassium dihydrogen phosphate was 0.6%， the severity of potato late blight was the least， and the control effect was 35.64% on day eight after treatment， and remained stable （>30%） 12 days after treatment. At the same time， spraying potassium dihydrogen phosphate increased the activity of six defense enzymes and soluble protein content to varying degrees in healthy and inoculated potato plants. Therefore， potassium dihydrogen phosphate can induce potato resistance to late blight during specific periods of time， and thus reduce the occurrence of potato late blight.

Key words

potassium dihydrogen phosphate; potato late blight; disease resistance

马铃薯晚疫病是由致病疫霉Phytophthora infestans（Mont.） de Bary引起的毁灭性卵菌病害，可造成产量损失20%～40%，甚至绝收，曾导致“爱尔兰大饥荒”［1］。目前，防治该病主要以选育抗病品种辅以化学防控为主，然而随着晚疫病菌群体结构的迅速变化，出现了品种抗病性丧失［2］、菌株产生抗药性［3］等问题。因此，探索和实施绿色防控技术尤为重要。

诱导抗病性是由多种生物或非生物因子所激发，依赖植物化学或物理防卫屏障的主动抗病过程［4］。能够激发诱导抗病性的各种因子称为激发子，目前已发现多种激发子可以通过迅速激活植物体内生理生化反应来引起一系列防御酶活性的增强及病程相关蛋白的积累，进而提高植物抗病性。主要有苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase， PAL）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化物酶（peroxidase， POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）、几丁质酶（chitinase， Chi）、β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanase， GLU）和可溶性蛋白（soluble protein， SP）等，它们的活性或含量变化与植株的抗病性密切相关［5］。如哈茨木霉Trichoderma harzianum T1055诱导向日葵对苗枯病的抗性［6］，枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis BS208诱导番茄对灰霉病的抗性［7］，苯并噻二唑诱导香蕉对枯萎病的抗性［8］，水杨酸诱导番茄对枯萎病的抗性［9］，亚磷酸钾诱导马铃薯对晚疫病的抗性等［10］。

磷酸二氢钾（KH2PO4）作为农业生产上常用的叶面肥，具有污染小、吸收快的特点，可显著提升作物的产量和品质［11］，也具备提升作物抗寒［12］、抗倒伏［13］及抗干热风［14］的能力，然而磷酸二氢钾在马铃薯抗晚疫病方面的研究未见报道。本研究通过对马铃薯喷施磷酸二氢钾后接种晚疫病菌，测定了不同浓度处理下晚疫病发生的严重度，并对6种防御酶活性及可溶性蛋白含量的變化情况进行分析，以期探究磷酸二氢钾能否影响马铃薯对晚疫病的抗性。

1 材料与方法

1.1 材料

供试马铃薯为中抗马铃薯晚疫病品种‘丽薯6号，由云南省丽江市农科所选育。供试晚疫病菌Phytophthora infestans菌株共12株，由云南农业大学马铃薯病害研究室保存，分别采自云南马铃薯大春作一季作区中的12个县市，涵盖了目前能够鉴定出的晚疫病菌的1～11个致病基因。

供试培养基为黑麦番茄培养基［3］。配制方法为：称取黑麦60 g/L，加入适量水后灭菌、榨汁、煮沸，筛网过滤，加入琼脂20 g/L，番茄汁150 mL/L、CaCO3 1.2 g/L，调节pH至6.5～7.0，灭菌备用。

栽培基质为蛭石、珍珠岩体积比1∶1的混合基质。试验所用肥料包括尿素（N≥46%）、过磷酸钙（P2O5≥12%）、硫酸钾（K2O≥52%）及磷酸二氢钾（有效成分≥99%，P2O5≥52%，K2O≥34%），除尿素购自安阳中盈化肥有限公司外，其他均购自河北先正农业科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 孢子悬浮液的制备

将12个晚疫病菌菌株分别接种至黑麦番茄培养基中，18℃黑暗培养10～14 d，使用无菌水冲洗刮下菌丝，270目无菌网筛过滤，用血球计数器调节孢子囊数目为5×104个/mL，然后将所有菌株菌悬液混合，置于4℃中1 h，释放游动孢子，备用。

1.2.2 喷施磷酸二氢钾后马铃薯晚疫病发生情况调查

试验在云南农业大学温室内进行，挑选经过催芽且大小一致的健康种薯种植于花盆中，每盆种植一个种薯。化肥施用量为尿素 4.4 g/盆、过磷酸钙 8.3 g/盆、硫酸钾3.9 g/盆，其中2/3的量与基质拌匀后装盆作为基肥，1/3的量作为追肥，齐苗后14 d进行追施。

种植后45 d，用无菌水将磷酸二氢钾配制成质量浓度分别为0%、0.15%、0.3%、0.6%、1.2%的溶液，于傍晚无风时将溶液喷洒至植株叶片，直到正反面均有明显液滴为止。每处理3盆，重复3次。磷酸二氢钾处理后4 d，使用1.2.1中制备的孢子悬浮液进行整株喷雾接种，然后用保鲜袋保湿24 h，以喷无菌水为对照。

接种后，每4 d调查1次病级，总共调查2次。分级标准按照田间药效试验准则（一） 杀菌剂防治马铃薯晚疫病：GB/T 17980342000中的标准［15］，根据调查结果计算病情指数和防效。

病情指数=∑（各级病叶数×相应病级值）×100/（调查总叶数×9）;

防效=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.2.3 试验设计及样品采集

经过预试验，发现使用不同浓度磷酸二氢钾处理马铃薯后接种晚疫病菌，以0.6%浓度处理发病最轻。因此在进行上述试验的同时，取与1.2.2中同一批种植且生长45 d的马铃薯，分别于当天和第4天按表1的方案进行处理（方法、接种浓度与1.2.2一致），每处理3盆，重复3次。分别于处理后0、2、4、6、8、10、12、14 d对同一处理各植株自顶端向下第3～5叶位长势一致、充分展开的复叶进行混合采样，每次采样3.0 g，然后立即放入冰盒中，使用液氮速冻后-80℃保存备用。

测定样品中防御酶活性及可溶性蛋白含量。

1.2.4 防御酶活性及可溶性蛋白含量的测定方法

PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量的测定分别采用苯丙氨酸法［8］、氮蓝四唑法［8］、愈创木酚法［8］、邻苯二酚法［16］、3，5二硝基水楊酸法［1718］、考马斯亮蓝G250法［19］，稍有修改。

1.3 数据分析

使用Excel进行数据统计，DPS 7.05进行单因素方差分析，多重比较方法为Duncan氏新复极差法。

2 结果与分析

2.1 喷施磷酸二氢钾后马铃薯晚疫病的发生情况

不同浓度的磷酸二氢钾喷施马铃薯植株后第4天接种晚疫病菌，之后每4 d调查发病情况，总共2次。结果表明，随着磷酸二氢钾施用浓度的增加，发病严重度逐渐减轻，超过一定浓度后，病害的发生加重。0.6%浓度处理的植株发病最轻，8 d时防效为35.64%，12 d时为30.94%。而1.2%浓度处理，虽然处理后8 d发病程度最低，但12 d时发病较重，8 d时防效达40.54%，但12 d时大幅下降，仅为17.40%。因此，磷酸二氢钾在一定时间段内可减轻马铃薯晚疫病的发生，喷施0.6%的磷酸二氢钾效果最佳（图1，表2）。

2.2 喷施磷酸二氢钾对马铃薯防御酶活性及可溶性蛋白含量的影响

喷施磷酸二氢钾可不同程度地提升健康和感病的马铃薯植株PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量。

2.2.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的变化

空白对照植株PAL活性呈先下降后缓慢上升然后稳定的趋势，而喷施磷酸二氢钾不接种晚疫病菌的处理（T1），处理后PAL活性迅速上升，4 d时显著高于对照，是对照的1.32倍。10 d时PAL活性达到最高水平，高出空白对照41.44%，随后有所下降，但仍显著高于对照。喷无菌水后接种晚疫病菌的处理（T2）、喷施磷酸二氢钾后接种晚疫病菌的处理（T3），处理后6 d植株PAL活性均急剧增加，分别是空白对照的1.60倍、2.06倍。8 d时T2、T3处理均达到峰值，T3处理PAL活性高于T2处理28.06%，随后均呈下降趋势，但T3处理相比T2处理仍具显著差异（表3）。

2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化

喷施磷酸二氢钾不接种晚疫病菌的处理（T1）在处理后

2 d植株SOD活性显著高于空白对照，10 d后T1处理和空白对照SOD活性均呈下降趋势，但T1处理SOD活性仍显著高于空白对照。喷无菌水后接种晚疫病菌的处理（T2）、喷施磷酸二氢钾后接种晚疫病菌的处理（T3），处理后植株SOD活性均显著增强，处理后6 d和8 d时T3处理SOD活性分别比T2处理高8.87%和12.45%。处理后10～14 d，T2、T3处理SOD活性均下降，但T3处理SOD活性仍处于较高水平，平均比T2处理高1.43 U/（g·min）且差异显著（表4）。

2.2.3 过氧化物酶（POD）活性的变化

喷施磷酸二氢钾可使植株POD活性快速增加，处理后2～8 d，喷施磷酸二氢钾不接种晚疫病菌的处理（T1）POD活性分别比空白对照高25.47%、52.20%、40.08%、44.90%，随后其POD活性持续下降，但仍显著高于空白对照。接种晚疫病菌后植株POD活性均急剧增加，处理后6 d和8 d时变化最为明显，喷无菌水后接种晚疫病菌的处理（T2）POD活性在6 d和8 d时分别是4 d时的2.09倍和2.27倍，而喷施磷酸二氢钾后接种晚疫病菌的处理（T3）POD活性在6 d和8 d时分别比T2处理高18.69%和16.20%。8 d后T2处理POD活性大幅下降，而T3处理下降幅度较小，且与T2处理相比具有显著差异（表5）。

2.2.4 多酚氧化酶（PPO）活性的变化

喷施磷酸二氢钾后植株PPO活性上升，处理后4 d，喷施磷酸二氢钾不接种晚疫病菌的处理（T1）相比空白对照达到显著水平，且在处理后4～14 d保持了较高活性，平均高出空白对照25.71%。喷无菌水后接种晚疫病菌的处理（T2）、喷磷酸二氢钾后接种晚疫病菌的处理（T3），处理后植株PPO活性均迅速提升，而T3处理的植株PPO活性提升更明显，处理后6 d时T2、T3处理分别比空白对照高25.50%、47.64%。8 d时，T2、T3处理达到最高水平，T3处理PPO活性比T2处理高15.54%。此后，T3处理在12 d内维持了较高水平，然后下降，而T2处理PPO活性迅速下降，12 d时与T3处理差异最显著，仅为T3处理植株PPO活性的74.68%（表6）。

2.2.5 几丁质酶（Chi）活性的变化

喷施磷酸二氢钾不接种晚疫病菌的处理（T1）在处理后2～12 d植株的Chi活性显著提高，平均比空白对照高0.94 U/（g·h），而空白对照Chi活性在整个采样期在一个较低的水平上下波动。接种晚疫病菌可导致植株Chi活性大幅增加，处理后6 d，喷无菌水后接种晚疫病菌的处理（T2）、喷施磷酸二氢钾后接种晚疫病菌的处理（T3）分别是空白对照的1.62、1.91倍。T2、T3处理在处理后6～10 d维持了较高的Chi活性，随后下降，且10～12 d时下降最为明显，T2处理降幅为19.76%，而T3处理降幅较低，仅为10.78%（表7）。

2.2.6 β1，3葡聚糖酶（GLU）活性的变化

喷施磷酸二氢钾不接种晚疫病菌的处理（T1）在处理后2～10 d植株GLU活性显著提高，随后虽有所下降，但其与空白对照仍具显著差异，而对照植株GLU活性一直处于较低的水平，无明显变化。喷无菌水后接种晚疫病菌的处理（T2）、喷施磷酸二氢钾后接种晚疫病菌的处理（T3），处理后GLU活性均急剧上升，处理后6 d时T2、T3处理GLU活性分别是空白对照的1.45、1.73倍，8 d时T2、T3处理GLU活性达到最高水平，且T3处理比T2处理高16.08%。此外，T3处理GLU活性在处理后6～10 d保持了较高水平，而T2处理的较高水平仅保持在6～8 d，持续时间短，之后T2、T3处理GLU活性大幅下降，但14 d时T3处理仍比T2处理高21.74%，而T2处理GLU活性已低于对照（表8）。

2.2.7 可溶性蛋白（SP）含量的变化

喷施磷酸二氢钾不接种晚疫病菌的处理（T1）植株SP含量显著提升，而对照植株SP含量变化较小。处理后2～14 d，T1处理植株SP含量平均比

0 d 高16.83%。接种马铃薯晚疫病菌后，植株SP含量均大幅上升，6 d时喷无菌水后接种晚疫病菌的

处理（T2）、喷施磷酸二氢钾后接种晚疫病菌的处理（T3）的SP含量相比空白对照分别增加了27.33%、46.48%。T2处理SP含量在处理后6～8 d维持在较高水平，第10天开始大幅下降，14 d时其SP含量已低于空白对照，而T3处理在处理后6～10 d处于比T2处理更高的水平，之后有所下降，但降幅较小（表9）。

综上，喷施磷酸二氢钾可降低马铃薯晚疫病发生的严重度，并提升植株防御酶活性及可溶性蛋白含量，进而诱导马铃薯对晚疫病的抗性，且处理后6～10 d最为明显。因此，可结合马铃薯晚疫病预警系统，在大田晚疫病发生前6～10 d喷施磷酸二氢钾，不仅可减轻晚疫病的发生，还可降低化学农药的施用量，实现马铃薯晚疫病绿色防控的同时增加马铃薯产量。

3 结论与讨论

近年来，诱导抗性作为一种稳定、有效的防治方法被广泛应用和研究。林敏等［10］利用亚磷酸钾处理马铃薯后，植株体内防御基因表达量、氧化酶活性及可溶性蛋白含量均显著提升，进而提升了马铃薯对晚疫病的抗性。朱毅勇等［20］使用磷酸盐处理黄瓜后，黄瓜POD、Chi、GLU活性明显提升，减轻了炭疽病的发生。Ata等［21］使用两种磷酸盐处理甜菜，均可诱导POD、PPO、PAL活性提升，使甜菜对锈病的抗性增强。本研究通过测定4个质量浓度的磷酸二氢钾处理马铃薯后晚疫病的发生情况，发现磷酸二氢钾可减轻马铃薯晚疫病的发生，且浓度为0.6%的处理晚疫病发生最轻，而浓度为1.2%的处理出现前期发病轻微，但后期发病加重的情况，未见相关报道可以参考，需要进一步加以验证。

病原菌和激发子的作用可引起植物体内多种防御酶活性及蛋白含量的变化，它们在抵抗病害过程中发挥了非常关键的作用。其中，PAL是苯丙烷代谢途径中的关键限速酶，大量植保素及酚类物质通过该途径合成［9］。SOD、POD可清除组织或细胞中过多活性氧，保护植株免受氧化作用造成的损伤。此外，POD还参与木质素的合成，也可将酚类物质氧化成对病原菌毒性更强的醌类物质［7，22］。Chi和GLU常协同表达，具有降解病原菌细胞壁中的几丁质和β1，3葡聚糖成分的作用。病程相关蛋白是植物受病原菌侵染后诱导产生的一类可溶性蛋白，其含量反映了植株在逆境胁迫下对自身的保护能力［23］。本研究发现喷施磷酸二氢钾后，均可显著提升马铃薯植株体内PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量，表明磷酸二氢钾可通过提升防御酶活性及可溶性蛋白含量的形式，诱导马铃薯植株对晚疫病的抗性，这与林敏等［10］、朱毅勇等［20］使用磷酸盐诱导植物抗性提升的研究结果相似。

综上，磷酸二氢钾可在一定时间段内诱导马铃薯对晚疫病的抗性，从而减轻晚疫病的发生。但本研究尚未对其他抗病机制进行深入探讨，因此关于喷施磷酸二氢钾后马铃薯植株防御基因的表达、防卫信号的识别和传递等方面的研究将是下一阶段工作的重点。此外，在使用磷酸二氢钾增强植株对晚疫病抗性的同时，综合运用多种防治措施，将更有利于实现马铃薯晚疫病的绿色防控。

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