孤雌产雌食胚赤眼蜂高温敏感阶段的研究

李明睿 王震刚 刘婷 匡悦 王强 李迎瑞 李博洋 刘向涛 吴雨聪 张海燕

摘要

胞内共生菌Wolbachia可诱导赤眼蜂产雌孤雌生殖，而高温可使感染Wolbachia的赤眼蜂产雄比例增加。本文以感染Wolbachia孤雌产雌生殖的食胚赤眼蜂Trichogramma embryophagum 为材料，采用30℃和35℃高温处理卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫等不同发育阶段的虫体，统计子代蜂发育历期、寄生数、羽化率和性比。结果表明，与25℃对照相比，高温缩短了子代蜂各发育阶段的历期，其中蛹、成虫和全世代历期显著缩短。处理的发育阶段和持续时间不同，子代的出雄率不同，而且随着处理时间的延长，对食胚赤眼蜂子代的寄生和羽化有一定的影响。基于高温处理后子代出雄率指标分析，F3代卵和幼虫经高温处理后代子代雄蜂比率最高，达到了20.54%和23.78%，明显高于預蛹期和蛹期处理的雄蜂率。结果表明，高温处理后感染Wolbachia的食胚赤眼蜂生殖方式改变的敏感发育阶段为卵期和幼虫期，本研究可为进一步揭示Wolbachia调控赤眼蜂生殖的机理提供理论参考。

关键词

Wolbachia; 食胚赤眼蜂; 孤雌产雌生殖; 发育阶段

中图分类号：

S 476.3

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022087

Sensitive stages of thelytokous parthenogenetic Trichogramma embryophagum infected by Wolbachia in response to high temperature

LI Mingrui1， WANG Zhengang1， LIU Ting1， KUANG Yue1， WANG Qiang1， LI Yingrui1，

LI Boyang1， LIU Xiangtao1， WU Yucong1， ZHANG Haiyan1，2*

（1. College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China; 2. Heilongjiang

Provincial Research Center for Engineering Technology of Straw Resource Utilization， Daqing 163319， China）

Abstract

The intracellular symbiotic Wolbachia can induce thelytokous parthenogenesis in Trichogramma， but the proportion of male offsprings of Trichogramma infected with Wolbachia will increase after treatment with

higher temperature. In this study， the eggs， larvae， prepupae， pupae and adults of infected Trichogramma embryophagum were treated at 30℃ and 35℃. The developmental duration， parasitism number， emergence rate and sex ratio of progenies were calculated. The results showed that high temperature shortened the developmental duration of the offspring， especially the developmental durations of pupa， adult and whole generation. The percentages of offspring males were different with different developmental stages treated and different treatment durations. The parasitism and emergence were changed with increasing treatment time. Based on the analysis of the percentages of offspring males under hightemperature treatment， the highest percentages of males were recorded when eggs and larvae were treated in F3 generation， reaching 20.54% and 23.78%， respectively， higher than those when prepupae and pupae were treated. The results suggested that the changes of reproductive pattern of T.embryophagum induced by Wolbachia were most sensitive to hightemperature treatment at egg and larval stages. This study provides a theoretical reference for further revealing the reproductive mechanism of Trichogramma associated with Wolbachia infection.

Key words

Wolbachia; Trichogramma embryophagum; thelytokous parthenogenesis; developmental stage

节肢动物胞内共生细菌沃尔巴克氏体Wolbachia广泛存在于自然界中［1］，可通过宿主细胞质（非细胞核遗传）向宿主子代垂直传播［2］。Wolbachia 可改变宿主生殖方式，诱导宿主细胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility，CI）（包括单向不亲和与双向不亲和）［35］、孤雌生殖（parthenogenesis inducing，PI）［产雄孤雌生殖（arrhenotoky，AY）与产雌孤雌生殖（thelytoky，TY）］［67］、遗传雄性的雌性化（feminization）［8］、雄性致死（malekilling）［9］等。近十年来，Wolbachia 改变宿主生殖方式的现象在蛛形纲、等足目和一些昆虫中均有报道［1014］。例如，Wolbachia pipientis可调控赤眼蜂发生孤雌产雌生殖［15］，同时Wolbachia的杀雄、胞质不亲和等特性也可以应用到其他昆虫中，这对改良天敌种群具有重要意义［1617］。

赤眼蜂是一类广泛应用于害虫生物防治的卵寄生蜂。其中，孤雌產雌生殖的赤眼蜂无需交配即可产下近100%的子代雌蜂，因此无需饲养雄蜂，大幅节约了生产成本［18］。目前已知Wolbachia可感染约20种赤眼蜂，如松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi、短管赤眼蜂T.pretiosum、螟黄赤眼蜂T.chilonis

、食胚赤眼蜂T.embryophagum和安荔赤眼蜂T.oleae等［1921］。研究发现，高温和抗生素对赤眼蜂体内Wolbachia影响显著，超过28℃的高温可使子代蜂出现雄性，且温度越高、处理时间越长子代蜂雄性比例越高［22］。此外，喂食抗生素也可使感染Wolbachia的赤眼蜂生殖方式部分或完全恢复为两性生殖［23］。研究发现，Wolbachia诱导的赤眼蜂产雌孤雌生殖现象取决于Wolbachia的滴度［24］，本课题组前期研究发现，除了滴度因素外，高温（30℃以上）会影响Wolbachia对宿主赤眼蜂生殖方式的调控。

本研究采用25、30℃和35℃分别处理食胚赤眼蜂各发育阶段（卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫），通过调查处理后子代蜂生殖表型，明确高温对Wolbachia调控赤眼蜂产雌孤雌生殖方式产生影响的关键阶段。研究结果将有助于揭示Wolbachia调控赤眼蜂生殖表型发生改变的机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蜂种：感染Wolbachia的孤雌产雌食胚赤眼蜂Trichogramma embryophagum （Hartig）由广东省农业科学院提供，在黑龙江八一农垦大学农学院养虫室饲养80代以上。

寄主米蛾卵：黑龙江八一农垦大学农学院养虫室饲养的米蛾Corcyra cephalonica（Stainton）所产新鲜卵。

1.2 试验方法

蜂种保种：将天然桃树胶均匀地涂抹在灭菌滤纸上，将新鲜米蛾卵均匀地洒在上面，在距离紫外灯10 cm处灭菌10 min，接蜂后将蜂卡置于25℃，相对湿度为70%的恒温培养箱内保种繁殖。

不同温度下感染Wolbachia的食胚赤眼蜂各阶段发育历期：取单头食胚赤眼蜂雌蜂，置于玻璃指形管内，给予含足量新鲜米蛾卵的卵卡（超过200粒米蛾卵），用棉花塞住管口，转移至25、30、35℃的人工气候箱中恒温培养，相对湿度均为70%，光周期为L∥D=12 h∥12 h。每隔8 h观察1次食胚赤眼蜂发育情况，统计卵期、幼虫期、预蛹期、蛹期和成虫期持续时间。

短期高温处理方法：取初羽化成虫60头，每15头为1组，每头单独放入一个小指形管内，放入新鲜卵卡（约200粒卵）供其寄生。试验分别设卵期、幼虫期、预蛹期和蛹期进行30℃或35℃高温处理，以25℃为对照温度。卵期高温处理：将接入卵卡的指形管转移到30℃或35℃，相对湿度70%的恒温培养箱中培养，寄生8 h去除种蜂，待寄生蜂卵期结束（去除种蜂后约1 d），将指形管重新放回25℃，相对湿度70%的条件下培养，当被寄生的米蛾卵变黑（此时赤眼蜂发育至蛹期）时从每组的卵卡（15张卵卡每张卡上取1～2粒）上随机挑取15粒以上待羽化出蜂的米蛾卵，用于出蜂后下一代的处理。幼虫期、预蛹期和蛹期的高温处理：接入卵卡的指形管在25℃，相对湿度70%的条件下培养8 h后去除种蜂，待卵发育至幼虫初期（去除种蜂后约2 d）、预蛹期（去除种蜂后约4 d）和蛹期（去除种蜂后约5 d）时 ，将指形管分别放入30℃或35℃，相对湿度70%的恒温培养箱中培养，其中幼虫和预蛹在高温下均处理1 d，蛹期处理3 d，而后将指形管重新放回25℃，相对湿度70%的条件下培养。羽化出蜂后代按上述方法继续处理，其中第1次处理的蜂为F0代，经高温处理1次后获得的子代蜂为F1代，第2次处理后羽化子代蜂为F2代，依次类推统计至F3代出蜂。

统计每一子代寄生数、羽化数，统计羽化率、雄蜂率。

寄生数为米蛾卵被寄生变黑的数量。

羽化率=羽化出蜂数/寄生卵粒数×100%;雄蜂率=羽化雄蜂数/羽化出蜂数×100%。

1.3 数据统计与分析

调查记录的试验数据经 Excel 整理后，不同处理的寄生数、发育历期均值首先进行单因素方差分析，对存在显著性差异的数据进一步采用 Duncan 氏新复极差法进行多重比较。羽化率及雄蜂百分率数据转换后再进行分析。显著性水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 孤雌产雌食胚赤眼蜂的发育历期

通过显微镜观察孤雌产雌赤眼蜂各发育阶段的特征及历期，结果见表1。

由表1可知，与25℃相比，30℃和35℃下食胚赤眼蜂蛹、成虫和全世代

历期均显著缩短，而两个高温处理之间赤眼蜂各阶段的发育历期无显著差异。

2.2 高温处理后孤雌产雌食胚赤眼蜂的生物学特性

2.2.1 高温处理食胚赤眼蜂不同发育阶段后各代的寄生、羽化情况

由表2可知，食胚赤眼蜂F0代卵、幼虫、预蛹和蛹经过30℃或35℃高温处理后，F1代的寄生数（19.61～22.86粒）、羽化率（64.43%～87.86%）与未经高温处理的对照（25℃）的寄生数和羽化率（23.88粒和81.04%）相比均无显著差异，35℃预蛹期处理的羽化率为87.86%，显著高于该温度下卵和幼虫处理后，以及30℃处理各阶段后F1代蜂的羽化率。30℃处理卵、幼虫、预蛹和蛹后F1代蜂的羽化率没有显著差异。

由表3可知，食胚赤眼蜂同一发育阶段经过连续两代30℃或35℃高温处理后，F2代的寄生数与25℃对照相比均没有显著差异，但30℃和35℃的卵处理其F2代的寄生数差异显著，分别为19.47粒和28.77粒，其他阶段经高温处理后F2代寄生数均无显著差异。30℃处理预蛹后F2代的羽化率最低，为66.35%，显著低于其他处理。35℃处理卵和幼虫，F2代羽化率分别为86.17%和84.27%，显著高于25℃时的羽化率。

由表4可知，食胚赤眼蜂同一发育阶段经过连续三代的高温处理后，除了30℃蛹处理的F3代寄生数为20.54粒，显著低于35℃预蛹处理外，其他各处理间及与对照间F3代的寄生数均无显著差异。羽化率统计结果表明，30℃卵处理F3代羽化率最低，为60.78%，其次为35℃预蛹处理，羽化率为61.54%，两者显著低于30℃蛹处理和35℃其他阶段的处理。35℃幼虫处理后羽化率最高，为83.45%，显著高于30℃卵、幼虫和预蛹处理。

2.2.2 食胚赤眼蜂各个发育阶段高温处理后子代的雄蜂率

研究发现，在25℃下，食胚赤眼蜂孤雌产雌，子代没有雄性个体出现，不同发育阶段虫体经30℃和35℃高温处理后，子代均羽化出雄蜂。卵、预蛹和蛹连续3代经30℃处理，随着连续处理代数增加，子代雄蜂率明显增加，其中卵处理后子代雄性个体比例随着处理代数增加而显著增加，到F3代雄蜂率最高，为20.54%（图1），幼虫期处理后子代F2代雄蜂率最高，也在20%左右，与F3代没有显著差异，但显著高于F1代的雄蜂率。比较同一世代的各处理之间的雄蜂率，可以看出，F1代、F2代的雄蜂率均以幼虫期处理较高，但F3代的雄蜂率以卵处理最高，F3代的卵、幼虫、预蛹處理的雄蜂率间没有显著差异，但三者均明显高于蛹期处理的雄蜂率。

卵、幼虫和蛹连续3代经35℃处理，随着处理代数的增加，子代雄蜂率增加，其中幼虫处理后子代雄性个体比例随着处理世代增加而显著增加，到F3代雄蜂率最高达23.78%（图2），卵处理的F1代和F3代间雄蜂率差异显著，F3代卵和幼虫处理的雄蜂率显著高于预蛹和蛹期处理的雄蜂率。

3 结论与讨论

关于温度对感染Wolbachia的赤眼蜂的影响已有较多研究，其中高温可以改变感染Wolbachia赤眼蜂的生殖特性也有报道［25］，但高温诱导孤雌产雌赤眼蜂生殖发生改变的敏感发育阶段至今没有报道，明确高温改变赤眼蜂生殖方式的敏感发育阶段，对于研究孤雌产雌赤眼蜂生殖具有重要意义。孤雌产雌的松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi经短期高温刺激，尤其是38℃高温刺激后羽化出蜂率和单卵出蜂数明显降低，其子代蜂各指标变化不明显，二代赤眼蜂均未有雄蜂出现，说明短期高温冲击没有对 Wolbachia 调控其宿主生殖方式的作用产生影响［26］。 随着温度的升高赤眼蜂体内的Wolbachia滴度会降低，在28℃到31℃中滴度随着代数的增加先下降后上升，雄蜂百分率和雌雄间体百分率却随着代数的增加呈先上升后下降再上升的趋势［29］。根据试验结果和现象推断，高温会促使感染Wolbachia的赤眼蜂由孤雌产雌转变为孤雌产雄;过高和过长的温度处理会降低Wolbachia对赤眼蜂的作用;所以适当的短时高温和选择不同发育阶段进行处理是本试验进行的关键。本研究连续高温处理3个世代，孤雌产雌品种食胚赤眼蜂生殖方式有所改变，而根据张海燕等［28］、潘雪红等［25］及宁素芳等［29］对不同种孤雌产雌赤眼蜂的研究，高温对松毛虫赤眼蜂和短管赤眼蜂的出雄率变化的影响较明显的结论略有不同，是否与食胚赤眼蜂体内Wolbachia菌系或赤眼蜂种类对高温的耐受性有关需进一步试验进行验证。

除了高温以外，其他外界环境因子如抗生素、交配等诱导孤雌产雌赤眼蜂生殖方式发生改变也有报道［25］。不同温度下与雄蜂交配不会改变 Wolbachia 感染引起的松毛虫赤眼蜂产雌孤雌生殖方式，抗生素处理和持续至少 20 d 的 32℃高温是改变感染 Wolbachia 的松毛虫赤眼蜂生殖方式的决定因素［27］。本试验孤雌产雌的食胚赤眼蜂各发育阶段在经过短期30℃和35℃高温处理后，子代出现了雄蜂，且处理的发育阶段不同、世代不同，子代恢复出雄的比率也不同，处理代数越多子代出现雄蜂的几率越大。短期高温处理卵和幼虫后生殖方式改变即出雄的几率较大，尤其是幼虫处理后变化较明显，预蛹期和蛹期高温处理后出雄率

變化不大，只有个别世代出现变化。说明高温对Wolbachia诱导赤眼蜂生殖改变的影响主要发生在卵期和幼虫期。田间释放赤眼蜂防治害虫的时候，都是选择赤眼蜂即将羽化出蜂的时期，所以田间生产应用过程中如遇高温不会影响寄生效果，这一研究结果为生产上释放孤雌产雌的赤眼蜂提供了参考。

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