牡丹皮提取物除草活性初步研究

贾然 田赐 李晶晶 封英建 赵雪萍 牛文韬 马树杰 张利辉 董金皋

摘要

為明确牡丹皮（Cortex Moutan Radicis）的除草活性并初步探索其活性成分分离条件，采用平皿法、土壤喷雾法及茎叶喷雾法测定了牡丹皮不同极性溶剂萃取物对反枝苋Amaranthus retroflexus和稗Echinochloa crusgalli的除草活性。平皿法测定结果显示，在1 mg/mL浓度下，牡丹皮正丁醇萃取物的除草活性最强，对反枝苋幼根和幼茎的抑制率分别为67.88%和65.71%，对稗草幼根和幼茎的抑制率分别为68.72%和71.32%;毒力测定结果表明，牡丹皮正丁醇萃取物对反枝苋幼根和幼茎的IC50分别为12.28 mg/L和19.67 mg/L，对稗草幼根和幼茎的IC50分别为43.35 mg/L和72.79 mg/L。土壤喷雾法和茎叶喷雾法

测定结果显示，在5 mg/mL浓度下，牡丹皮正丁醇萃取物对反枝苋和稗草的鲜重抑制率最高，

其中土壤喷雾法对反枝苋和稗草的鲜重抑制率分别为81.43%和 83.18%；茎叶喷雾法

对两种杂草的鲜重抑制率分别为80.83%和83.65%。由此可见，牡丹皮的除草活性成分主要集中在正丁醇萃取物中，值得进一步研究。

关键词

牡丹皮萃取物; 反枝苋; 稗; 除草活性; 植物源农药

中图分类号：

S 482.49

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022176

A preliminary study of the herbicidal activity of the extracts from Cortex Moutan Radicis

JIA Ran1， TIAN Ci1， LI Jingjing1， FENG Yingjian1， ZHAO Xueping2， NIU Wentao1，MA Shujie1， ZHANG Lihui1*， DONG Jingao1

（1. College of Plant Protection， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， China;

2. Xingtai Modern Vocational School， Xingtai 054000， China）

Abstract

In order to clarify the herbicidal activity of Cortex Moutan Radicis and preliminarily explore the separation conditions， the herbicidal activities of different extracts from the Cortex Moutan Radicis against Amaranthus retroflexus and Echinochloa crusgalli were determined by bioactivity assay in the laboratory. The plating method showed that the nbutanol extracts of the Cortex Moutan Radicis （1 mg/mL） had the strongest herbicidal activity， with an inhibition rate of 67.88% and 65.71% against young roots and stems of A.retroflexus， and 68.72% and 71.32% against young roots and stems of E.crusgalli， respectively. Further toxicity assays showed that the IC50 values of nbutanol extracts of Cortex Moutan Radicis were 12.28 mg/L and 19.67 mg/L against young roots and stems of A.retroflexus， 43.35 mg/L and 72.79 mg/L against  E.crusgalli， respectively. The soil spray method showed that the nbutanol extracts of Cortex Moutan Radicis （5 mg/mL） had the strongest herbicidal activity， with a fresh weight inhibition rate of 81.43% and 83.18% against A.retroflexus and E.crusgalli， respectively. The nbutanol extracts of Cortex Moutan Radicis also had the strongest activity by using the stemleaf spray method， with a fresh weight inhibition rate of 80.83% and 83.65% against A.retroflexus and E.crusgalli， respectively. It suggested that the herbicidal active components of Cortex Moutan Radicis are mainly concentrated in the nbutanol extracts， and the active compounds are worth further investigation.

Key words

Cortex Moutan Radicis extracts; Amaranthus retroflexus; Echinochloa crusgalli; herbicidal activity; botanical pesticide

杂草是农业生产过程中的最大威胁，它们与植物竞争水分、营养和光照，造成了巨大的经济损失［12］。施用化学除草剂是杂草防除的有效办法，然而除草劑的大量使用会对环境和人类健康造成负面影响，并增加杂草的抗药性。面对每年数以百计的抗性杂草增长，研发新型除草剂以解决杂草的抗药性问题十分重要［34］。植物源除草剂是新型除草剂创制的重要来源。目前已在30多科植物中发现了千余种除草活性物质［5］。这些植物源除草活性物质大多经有机溶剂提取分离获得，毛花茶茱萸Icacina trichantha的乙酸乙酯提取物icacinol 对双子叶杂草具有较好的种子萌发抑制活性［6］;刺苞菜蓟Cynara cardunculus甲醇提取物对绛三叶Trifolium incarnatum、水飞蓟Silybum marianum和川杜若Pollia miranda的苗前苗后抑制活性均与商业化除草剂壬酸相当，并首次从中分离到除草活性物质杨梅素［7］;中国粗榧Cephalotaxus sinensis乙醇提取物中的生物碱等均具有较好的除草活性［8］。已有研究表明，植物精油中也存在大量的除草活性物质，葛缕子Carum carvi精油主要成分香芹酮和柠檬烯对稗草Echinochloa crusgalli具有较高的除草活性［9］;此外，松科Pinaceae植物精油中的α蒎烯和β蒎烯类化合物［10］，芸香科Rutaceae植物精油中的柠檬烯和柠檬醛［11］都具有良好的除草活性。许多来源于植物的除草活性成分可作为先导化合物，以紫苏Perilla frutescens植物中提取的紫苏醛为先导，衍生合成的secpmenthane7amine系列化合物，对稗草的除草活性与草甘膦和敌草隆相当［12］。可见，具有除草活性的植物提取物及其活性成分具有开发成新型植物源除草剂的潜力。

筛选和评价植物资源的除草活性，是植物源农药研发的重要基础性工作［13］。牡丹皮（Cortex Moutan Radicis）在中药学中称“丹皮”，来源于毛茛科植物牡丹Paeonia×suffruticosa的干燥根皮，素有保肾护肝，安神定气的功效［14］。近期研究发现牡丹皮可以保护神经系统免受帕金森诱导药物伤害［15］，促进血液循环等［16］。牡丹皮乙酸乙酯萃取物对根结线虫Meloidogyne spp.具有毒杀活性［17］，丙酮萃取物对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea等具有抑制作用［18］;牡丹皮内的丹皮酚对玉米象Sitophilus zeamais、锯谷盗Oryzaephilus surinamensis和马铃薯块茎蛾Phthorimaea operculella等的幼虫具有忌避作用［1920］。在除草活性研究上，已有关于牡丹不同器官粉末对反枝苋和稗草的抑制活性报道［2122］。实验室前期通过对100余种植物提取物除草活性筛选，发现牡丹皮提取物对反枝苋等杂草具有较好的除草活性，有进一步研究价值［23］。然而，对牡丹皮提取物的盆栽除草活性未见系统研究。

因此，本研究以牡丹皮为研究对象，以反枝苋和稗草为供试杂草，采用平皿法、土壤喷雾法及茎叶喷雾法测定不同溶剂萃取物对反枝苋和稗草幼苗生长的影响及盆栽除草活性。研究结果可为牡丹皮的开发应用奠定基础，为新型植物源除草剂的研发提供资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物样品

牡丹皮购自河北省安国市冷背药材有限公司;稗Echinochloa crusgalli和反枝苋Amaranthus retroflexus种子均采集于河北省保定市莲池区南二环路边荒地。

1.1.2 化学试剂

95%乙醇，分析纯石油醚（petroleum ether，PE;沸程60～90℃），分析纯乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）购自天津市福晨化学试剂厂;分析纯正丁醇（nbutanol，NBA）购自天津新通精细化工有限公司;吐温80 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;50%乙草胺乳油（EC），购自山东侨昌现代农业有限公司。

1.1.3 试验仪器

CP214电子天平，购自奥豪斯仪器（上海）有限公司;YE6K815351移液枪，购自大龙兴创实验仪器有限公司;HWS型恒温恒湿培养箱，购自宁波东南仪器有限公司;RE300旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂;SHDⅢ型循环水式多用真空泵，购自浙江南光泵业有限公司;3WP2000型行走式喷雾塔，购自北京金洋万达科技有限公司。

1.2 牡丹皮不同溶剂萃取物的制备

取干燥牡丹皮10 kg粉碎，加入2倍95%乙醇浸提72 h，重复提取3次;滤液在50℃减压蒸馏浓缩，得到牡丹皮乙醇浸膏。将上述浸膏，用少量乙醇溶解后用水捏溶，用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取24 h，萃取物分别浓缩制得石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏。

1.3 不同溶剂萃取物除草活性测定

1.3.1 平皿法测定萃取物对杂草幼根和幼芽的抑制活性

在直径9 cm的平皿中放入两层滤纸，将杂草种子平铺于滤纸上，加入适量蒸馏水，使种子充分吸水，置于温度（25±1）℃，相对湿度（40±7）%，L∥D=16 h∥8 h的恒温恒湿培养箱内培养至种子露白时使用。取不同溶剂萃取物0.01 g加入10 mL 0.5%吐温80水溶液中，配制为浓度1 mg/mL的药液备用。在直径为9 cm的平皿上放入两层滤纸，选取露白的杂草种子20粒放在滤纸上，加入5 mL 1 mg/mL萃取物药液。乙草胺10 mg（有效成分，下同）加入10 mL 0.5%吐温80水溶液中为阳性对照，0.5%吐温80水溶液为空白对照，每处理重复3次。培养7 d后测定根长、茎长，计算抑制率。

抑制率=［对照组根（芽）长－处理组根（芽）长］/对照组根（芽）长×100%。

将活性最高的萃取物稀释为100、50、25、12.5 mg/L和6.25 mg/L;对照药剂50%乙草胺EC稀释为40、20、10、5 mg/L和2.5 mg/L，进一步测定其对杂草幼根幼芽的抑制毒力。

1.3.2 土壤喷雾法测定萃取物对杂草的鲜重抑制率

取不同溶剂萃取物0.05 g加入10 mL 0.5%吐温80水溶液中，配成5 mg/mL的药剂备用;对照药剂50%乙草胺EC根据田间推荐剂量配制成2.75 mg/mL的药液备用。将土壤过筛风干后装入直径20 cm的花盆中，将露白的反枝苋和稗草种子各10粒分别均匀播撒于土壤表面，覆盖0.5～1 cm的细土。播种后保持土壤湿润24 h，使用3WP2000型行走式喷雾塔进行土壤喷雾，同时设空白对照（0.5%吐温 80 水溶液），每处理3个重复。培养期间通过底部渗漏法补水，在温度（25±2）℃，相对湿度（40±5）%的温室中常规培养。培养7 d后，稗长至2～3叶期，反枝苋长至2叶期。称取杂草鲜重，计算鲜重抑制率。

鲜重抑制率=（对照组杂草鲜重－处理组杂草鲜重）/对照组杂草鲜重×100%。

1.3.3 茎叶喷雾法测定萃取物对杂草的鲜重抑制率

试验药剂及用量与土壤喷雾法相同。将露白的反枝苋和稗草种子各10粒分别点种在小花盆（7 cm×7 cm×10 cm）中，培养至2～4叶期，使用3WP2000型行走式喷雾塔进行茎叶喷雾，设空白对照（0.5%吐温 80水溶液），每处理3个重复。培养期间通过底部渗漏法补水，在温度（25±2）℃，相对湿度（40±5）%的温室中常規培养。定期观察记载供试杂草的生长状态，14 d后称取地上部分鲜重并计算抑制率。

1.3.4 统计与分析

采用SPSS 22.0软件的Probit分析法求出抑制中浓度（IC50）、置信区间等相关参数。

2 结果与分析

2.1 牡丹皮不同溶剂萃取物

牡丹皮10 kg经乙醇室温提取得浸膏805 g，产率8.05%;所得浸膏经不同溶剂萃取，分别得石油醚浸膏235 g，产率2.35%;得乙酸乙酯浸膏243 g，产率2.43%;得正丁醇浸膏231 g，产率2.31%。

2.2 不同溶剂萃取物除草活性

2.2.1 对反枝苋和稗草幼苗生长的影响

平皿法测定结果如图1所示。在1 mg/mL浓度下，牡丹皮不同极性萃取物对反枝苋和稗草幼苗生长均具有一定的抑制作用。石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对反枝苋幼根的抑制率分别为40.23%、45.83%和67.88%，对反枝苋幼茎的抑制率分别为42.57%、46.91%和65.71%;3种有机溶剂萃取物对稗草的抑制活性中以正丁醇萃取物的活性最高，对稗草幼根幼芽的抑制率分别为 68.72%和71.32%，仅次于对照药剂5%乙草胺EC。由此可见，牡丹皮的除草活性成分主要集中在正丁醇萃取物中。

进一步测定活性最强的正丁醇萃取物对反枝苋和稗草幼根、幼芽的毒力，结果（表1）显示，牡丹皮正丁醇萃取物对反枝苋幼根、幼芽均具有较强的抑制作用，IC50分别为12.28 mg/L和19.67 mg/L，与对照药剂乙草胺的抑制作用相当；对稗草幼根、幼芽的IC50值分别为43.35 mg/L和72.79 mg/L，略低于对照药剂乙草胺对稗草幼根（IC50=29.58 mg/L）和幼芽（IC50=10.99 mg/L）的抑制作用。

2.2.2 对反枝苋和稗草植株的活性—土壤喷雾法

牡丹皮不同极性萃取物对反枝苋和稗草幼苗生长均具有一定的抑制作用，石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对反枝苋鲜重抑制率分别为53.61%、61.25%和81.43%;对稗草的抑制率分别为58.25%、62.46%和83.18%。由此可见，正丁醇萃取物对两种杂草的苗前除草活性最强，仅次于对照药剂乙草胺对反枝苋（93.35%）和稗草（96.16%）的活性（图2）。

2.2.3 对反枝苋和稗草植株的活性—茎叶喷雾法

牡丹皮石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对反枝苋鲜重抑制率分别为41.37%、59.92%和80.83%;对稗草的鲜重抑制率分别为46.66%、68.75%和83.65%。正丁醇萃取物对两种杂草的鲜重抑制率最高，仅次于对照药剂乙草胺对反枝苋（90.21%）和稗草（94.46%）的鲜重抑制率。

3 结论与讨论

牡丹皮不同溶剂萃取物对双子叶杂草反枝苋和单子叶杂草稗草均具有较好的除草活性，其中正丁醇萃取物的除草活性最强。大量研究表明，许多植物提取物及萃取物具有较好的除草活性，Mekky等发现罗勒Ocimum basilicum的甲醇提取物对苋属Amaranthus杂草的IC50为200 mg/L［24］;孙永艳等发现虎刺楤木Aralia armata的甲醇提取物对香丝草Erigeron bonariensis的IC50为409 mg/L［25］;石蝉草Peperomia blanda乙醇提取物对苘麻Abutilon theophrasti和稗草根长的IC50分别为730 mg/L和800 mg/L［26］。此外，从具有除草活性的植物中分离出许多活性成分，这些化合物具有较好的除草活性。张城嘉等在棉籽壳的乙醇提取物中分离得到亚油酸，对稗草的IC50为14.5 mg/L［27］;卢海博等从黄皮Clausena lansium甲醇提取物中分离得到的黄皮素内酯Ⅱ对稗草根、茎的IC50分别为 66.9、78.4 mg/L［28］。Shao等鉴定了白茎绢蒿Seriphidium terraealbae中β侧柏酮在 20 mg/L 时对反枝苋根长的抑制率为 70.6%［29］。本研究发现牡丹皮正丁醇萃取物对反枝苋幼根和幼芽的IC50分别为12.28 mg/L和19.67 mg/L，与对照药剂乙草胺效果相当;对稗草幼根和幼芽的IC50分别为43.35 mg/L和72.79 mg/L，可见牡丹皮正丁醇萃取物具有开发成新型植物源除草剂的潜质，值得进一步研究。

牡丹皮除草活性成分主要集中在正丁醇萃取物中，可能为极性较大的大分子化合物。目前已报道的植物源除草活性物质主要包括萜烯类、生物碱类、香豆素类和醌类等［5］。已有研究表明，牡丹皮的主要化学成分为酚类、萜类、甾醇类和黄酮類等［30］。基于牡丹皮正丁醇萃取物优异的除草活性，有必要针对牡丹皮中的高极性化合物进行进一步分离。

参考文献

［1］ VAN EVERT F K， FOUNTAS S， JAKOVETIC D， et al. Big data for weed control and crop protection ［J］. Weed Research， 2017， 57（1）： 218233.

［2］ ARANITI F， MANCUSO R， LUPINI A， et al. Phytotoxic potential and biological activity of three synthetic coumarin derivatives as new naturallike herbicides ［J］. Molecules， 2015， 20（10）： 1788317902.

［3］ FENG Gang， CHEN Min， YE Huochun， et al. Herbicidal activities of compounds isolated from the medicinal plant Piper sarmentosum ［J］. Industrial Crops and Products， 2019， 132： 4147.

［4］ DAYAN F E， OWENS D K， DUKE S O. Rationale for a natural products approach to herbicide discovery ［J］. Pest Management Science， 2012， 68（4）： 519528.

［5］ VYVYAN J R. Allelochemicals as leads for new herbicides and agrochemicals ［J］. Tetrahedron， 2002， 58（9）： 16311646.

［6］ ZHAO Ming， GUO B， ONAKPA M M， et al. Activity of icacinol from Icacina trichantha on seedling growth of Oryza sativa and Arabidopsis thaliana ［J］. Journal of Natural Products， 2017， 80（12）： 33143318.

［7］ SOFIENE B K， RE B I B， HANAFI M， et al. Screening of Tunisian plant extracts for herbicidal activity and formulation of bioherbicide based on Cynara cardunculus ［J］. South African Journal of Botany， 2019， 128： 6776.

［8］ 马树杰， 刘琳， 芦小鹏， 等. 中国粗榧生物碱的除草活性［J］. 中国农业科学， 2016， 49（19）： 37463753.

［9］ AGNIESZKA S， KATARZYNA M， AGNIESZKA K， et al. Carum carvi L. essential oil： A promising candidate for botanical herbicide against Echinochloa crusgalli （L.） P. Beauv. in maize cultivation ［J/OL］. Industrial Crops & Products， 2019， 140（8）： 111652. DOI： 10.1016/j.indcrop.2019.111652.

［10］DE MARTINO L， MANCINI E， DE ALMEIDA L F R， et al. The antigerminative activity of twentyseven monoterpenes ［J］. Molecules， 2010， 15（9）： 66306637.

［11］FAGODIA S K， SINGH H P， BATISH D R， et al. Phytotoxicity and cytotoxicity of Citrus aurantiifolia essential oil and its major constituents： limonene and citral ［J］. Industrial Crops and Products， 2017， 108： 708715.

［12］ZHANG Hongmei， CHEN Yuxiang， XU Shichao， et al. Design， synthesis， and herbicidal activity of secpmenthane7amine derivatives as botanical herbicides ［J］. RSC Advances， 2021， 11： 2720727214.

［13］陳万义， 王明安. 对我国植物源农药研发的思考［J］. 现代农药， 2002（2）：14.

［14］胡云飞， 徐国兵. 牡丹皮及其主要成分丹皮酚的药理作用研究进展［J］. 安徽医药， 2014， 18（4）： 589592.

［15］朴颖， 宋艺兰， 李良昌， 等. 牡丹皮乙醇提取物对帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元功能障碍的保护作用［J］. 延边医学院学报， 2021， 44（2）： 8992.

［16］YANG Xiaolu， XUE Xingyang， LIN Yan， et al. Chemical constituents from the Moutan Cortex charcoal and their potential coagulation activities ［J］. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences， 2018， 27（9）： 608616.

［17］馬喆. 10种植物提取物对南方根结线虫毒杀活性研究［J］. 中国植保导刊， 2019， 39（6）： 2226.

［18］朱立成， 王祥胜， 刘文， 等. 牡丹皮等16种中草药提取物抑制植物病原菌的研究［J］. 植物保护， 2007， 33（3）： 8386.

［19］夏传国， 陈杰林， 李隆术， 等. 丹皮及其提取物对几种中药材仓储害虫的忌避作用研究［J］. 粮食储藏， 2000（1）： 39.

［20］吴梅， 韩瑞， 周典， 等. 丹皮酚对马铃薯块茎蛾雌虫产卵选择及幼虫的忌避作用研究［J］. 环境昆虫学报， 2021， 43（2）： 500506.

［21］罗小勇. 牡丹不同器官的除草活性研究［J］. 植物保护， 2011， 37（2）： 8790.

［22］郭凤， 罗小勇. 牡丹叶及其不同溶剂提取物对生菜等幼苗生长的抑制效应［J］. 杂草科学， 2012， 30（3）： 2126.

［23］李晶晶， 田赐， 王明思， 等. 113种植物的乙醇提取物对反枝苋和马唐种子萌发及生长的抑制活性［J］. 中国生物防治学报， 2022， 38（2）： 374382.

［24］MEKKY M S， HASSANIEN A， KAMEL E M， et al. Allelopathic effect of Ocimum basilicum L. extracts on weeds and some crops and its possible use as new crude bioherbicide ［J］. Annals of Agricultural Sciences， 2019， 64（2）： 211221.

［25］孙永艳， 桑晓清， 杨文杰， 等. 6种植物甲醇提取物对外来入侵杂草的除草活性［J］. 华中农业大学学报， 2012， 31（3）： 346350.

［26］闫超， 陈敏， 周颖， 等. 石蝉草乙醇提取物除草活性初探［J］. 植物保护， 2018， 44（2）： 199203.

［27］张城嘉， 李祖任， 柏连阳. 棉籽壳中除草活性物质提取及鉴定［J］. 农药学学报， 2019， 21（2）： 146150.

［28］卢海博， 万树青. 黄皮甲醇提取物的除草活性及有效成分研究［J］. 农药， 2012， 51（7）： 539542.

［29］SHAO Hua， HU Yunxia， HAN Caixia， et al. Chemical composition and phytotoxic activity of Seriphidium terraealbae （krasch.） Poljakov （Compositae） essential oil ［J/OL］. Chemistry & Biodiversity， 2018， 15（11）： e1800348. DOI： 10.1002/cbdv.201800348.

［30］王祝举， 唐力英， 赫炎. 牡丹皮的化学成分和药理作用［J］. 现代药物与临床， 2006（4）： 155159.

（责任编辑：杨明丽）