藜麦黑茎病拮抗细菌的筛选及与杀菌剂协同防治作用

孙江伟 陈亚蕾 殷辉 周建波 秦楠 吕红 任璐 赵晓军

摘要

為安全高效防治藜麦黑茎病，减少化学药剂施用量，筛选出对藜麦黑茎病菌Ascochyta caulina有良好抑制作用的拮抗细菌，分别采用平板对峙法和菌丝生长速率法测定拮抗细菌及杀菌剂对藜麦黑茎病菌的室内毒力;初步筛选出抑菌效果良好的拮抗菌和杀菌剂，采用稀释涂布平板法测定不同杀菌剂与拮抗细菌的相容性，并采用Horsfall法确定最佳复配比例，以确定的最佳复配比例进行田间防效测定。试验初步筛选出2株对A.caulina具有较好抑菌活性的拮抗细菌LS3和LS10，及室内毒力较高的2种杀菌剂戊唑醇和咪鲜胺。经过生物相容性试验最终选出戊唑醇和拮抗细菌LS3为最佳组合，其中，戊唑醇对A.caulina的EC50为1.78 μg/mL，LS3菌株对其EC50为2.37×105 cfu/mL，LS3初步鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp.;在各自EC50浓度下戊唑醇和LS3体积比为6∶4复配时对A.caulina抑制率达59.24%，IR值为1.003，具有加和作用，为最佳复配比例。以筛选出的0.5%木质素磺酸钠作为助剂时，该复配比例对藜麦黑茎病的田间防效达71.93%，高于单独使用杀菌剂或拮抗细菌发酵液的防治效果。因此，戊唑醇与拮抗细菌LS3复配施用可有效防治藜麦黑茎病，二者混配使用情况下可减少40%杀菌剂使用量，研究结果为藜麦黑茎病的防治提供理论依据。

关键词

藜麦黑茎病; 拮抗细菌; 菌药联用; 田间防治效果

中图分类号：

S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022098

Screening for antagonistic bacteria against quinoa black stem and its synergistic effects with fungicides

SUN Jiangwei， CHEN Yalei， YIN Hui， ZHOU Jianbo， QIN Nan， L Hong， REN Lu*， ZHAO Xiaojun*

（College of Plant Protection， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， China）

Abstract

In order to prevent quinoa black stem disease safely and efficiently and reduce the usage of chemical fungicides， the antagonistic bacteria with good inhibitory effect on Ascochyta caulina were screened. The virulence of antagonistic bacteria and fungicides against A.caulina was determined indoors by plate confrontation method and mycelial growth rate method. After preliminary screening of antagonistic bacteria and fungicides with good antifungal effect， the compatibility of different fungicides and antagonistic bacteria was determined by the dilution coating method. The Horsfall method was used to determine the best mixing ratio for field control efficacy test. The results showed that two antagonistic bacteria LS3 and LS10 with better antifungal activity against A.caulina and two fungicides tebuconazole and prochloraz with greater indoor virulence were initially obtained. After biocompatibility tests， tebuconazole and antagonistic bacteria LS3 were finally selected as the best bacteriumfungicide combination. The EC50 value of tebuconazole was 1.78 μg/mL， and the EC50 value of LS3 was 2.37×105cfu/mL， which was preliminarily identified as Bacillus sp.. When the volume ratio of tebuconazole and LS3 was 6∶4， the inhibition rate of the combination against A.caulina was 59.24%， and the IR value was 1.003. This combination had an additive effect and was regarded as the best mixing ratio. In addition， field control efficacy of the combination adding 0.5% sodium lignosulfonate as the auxiliary agent against quinoa black stem disease reached 71.93%， which was higher than the control efficacy achieved by fungicide or antagonistic bacterial fermentation broth alone. Therefore， the mixing formulation of tebuconazole and antagonistic bacteria LS3 can effectively prevent quinoa black stem disease， and the combined use of bacteria and fungicide can reduce the usage of fungicide by 40%. Our study provides a theoretical basis for the prevention and control of quinoa black stem disease.

Key words

quinoa black stem disease; antagonistic bacteria; combination of bacteria and fungicide; field control efficacy

藜麦Chenopodium quinoa又称昆诺阿藜、南美藜等，是印第安人传统食物，有“粮食之母”之称［1］。藜麦因具有高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖等特点被誉为最适宜人类的全营养食品。但随着藜麦的广泛种植，在其生长过程中各种病害也相继出现［23］，在我国已报道的藜麦病害有多变霜霉Peronospora variabilis引起的霜霉病，藜尾孢Cercospora chenopodii和成团泛菌Pantoea agglomerans引起的叶斑病，茎生壳二孢Ascochyta caulina引起的黑茎病等。其中，藜麦黑茎病是危害藜麦茎部的新病害，2017年在山西忻州市静乐县首次发现，其在温度15～25℃条件下更容易发生。典型症状是在茎上形成黑色坏死病斑，病斑可完全包裹茎，引起倒伏、籽粒空瘪和不育。茎生壳二孢A.caulina主要侵染藜麦茎部并产生大量分生孢子，偶见侵染藜麦叶片。藜麦黑茎病在山西静乐县的发病率约为80%，目前，生产上对藜麦黑茎病主要使用化学防治的方法，但由于对病害认识不清，防治不及时，损失巨大，甚至绝收［48］。

虽然采用杀菌剂防治藜麦黑茎病速度快、效率高、方便简单，但由于农民对该病害缺乏正确认识，盲目使用化学药剂［910］，且藜麦黑茎病发病期主要在藜麦开花期到结穗期，此时对茎秆发病部位喷施杀菌剂，易污染籽粒，影响藜麦品质。

生物防治作为化学防治的替代手段之一，可以有效减少化学农药的使用。生防菌种类繁多，目前已广泛应用的生防真菌包括木霉Trichoderma spp.［11］、青霉Penicillium spp.［12］、球毛壳Chaetomium globosum［13］等；生防细菌包括芽胞杆菌Bacillus spp.、链霉菌Streptomyces spp.等［14］。芽胞杆菌是开发微生物源农药的重要资源，目前在生物防治中得到广泛研究和应用［15］。但生物防治也存在防效稳定性差、显效慢、大田防效差等弊端［16］，一些生防菌的研究还停留在筛选、鉴定、抑菌物质抗菌分析阶段［1718］。

生防菌和杀菌剂联用在植物病害防治研究方面已取得显著成效［19］。谷春燕等［20］研究了解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens与氟啶胺协同防治草莓灰霉病;黄小琴等［21］发现硫酸链霉素和解淀粉芽胞杆菌复配防治烟草青枯病防效显著高于单剂；马志强等［22］发现哈茨木霉Trichoderma harzianum与啶酰菌胺联用后防治番茄灰霉病表现为增效。本研究以藜麦黑茎病病原菌A.caulina为靶标菌，筛选对其有良好抑制作用的拮抗细菌，并将拮抗细菌和杀菌剂进行复配，探讨对藜麦黑茎病的协同防治作用，为该病害的防治提供理论依据，为菌药联用、减药技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

藜麦黑茎病病原菌Ascochyta caulina从山西省静乐县藜麦种植园发病的藜麦植株上分离、纯化获得。拮抗细菌ZJ1分离自醉鱼草Buddleja lindleyana Fortune茎部，LF17分离自苹果Malus pumila Mill.树皮部，LS1～LS10分离自藜麦穗部，均由山西农业大学植物保护学院果蔬病害课题组分离、纯化并保存。

1.1.2 试验药剂和培养基

98%啶氧菌酯原藥，湖北健源化工有限公司提供;96.8%苯醚甲环唑原药，杭州大阳化工有限公司提供;97.2%咪鲜胺原药，山东潍坊润丰化工有限公司提供;98.4%甲基硫菌灵原药和97.1%嘧菌酯原药，山东西亚化学工业有限公司提供;93%百菌清原药，利民化学有限责任公司提供;90%氟吗啉原药，沈阳化工研究院提供;98.5%烯酰吗啉原药，广东中迅农科股份有限公司提供;98%甲霜灵原药，浙江禾本科技有限公司提供;96%乙霉威原药和95%三唑酮原药，河北威远生物化工股份有限公司提供;97.3%戊唑醇原药，山东华阳科技股份有限公司提供;430 g/L戊唑醇悬浮剂（SC），华北制药集团爱诺有限公司，市售品;10%苯醚甲环唑水分散粒剂（WG），先正达南通作物保护有限公司，市售品。

木质素磺酸钠、吐温80、亚甲基双萘磺酸钠（NNO）、十二烷基磺酸钠、聚乙烯比咯烷酮、丙酮均为分析纯。

培养基有PDA、NA、NB培养基。

1.2 杀菌剂对A.caulina的室内毒力测定

采用菌丝生长速率法测定各杀菌剂对A.caulina的抑制作用。各杀菌剂用丙酮溶解后，用无菌水稀释成所需浓度，与PDA培养基按1∶9比例制作为100 μg/mL和10 μg/mL的含药平板，以无药含相同浓度丙酮溶液的PDA培养基为对照。在预培养7 d的A.caulina菌落边缘取直径5 mm菌饼接于含药培养基平板中央，每处理重复3次，置于培养箱中，在25℃，光周期L∥D=12 h∥12 h条件下培养。10 d后测量菌落直径并计算抑制率。

抑制率=（對照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-5）×100%。

从上述12种杀菌剂中选取2种抑菌效果明显的杀菌剂，测定其EC50。将杀菌剂用丙酮溶解后，用无菌水稀释成所需浓度与PDA按1∶9的比例制作为0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00 μg/mL终浓度的含药PDA平板，以无药PDA培养基为对照。按上述方法和培养条件接种和培养A.caulina，每处理重复3次。10 d后测量菌落直径计算抑制率，并计算毒力回归方程、EC50、95%置信限、卡方值。

1.3 拮抗细菌的筛选

采用平板对峙法测定细菌菌株ZJ1、LF17及LS1～LS10对A.caulina的菌丝生长抑制率。在预培养7 d的A.caulina菌落边缘取5 mm菌饼接于PDA中央，在距离菌饼2 cm的4个位置对称接同种拮抗菌，以只接病原菌不接细菌的PDA为对照。培养条件同1.2。10 d后，测量A.caulina菌落直径并计算抑制率。

对初筛有抑菌效果的拮抗细菌采用滤纸片法［23］进行定量复筛。取少量拮抗细菌于NB培养基中，25℃、160 r/min下振荡培养24 h，制成种子液，将种子液与NB培养基1∶100（V/V）混合，继续振荡培养48 h制成发酵液。取A.caulina菌饼（5 mm）接于PDA中央，在距离菌饼2 cm的4个位置对称放置直径5 mm的灭菌滤纸片并滴加10 μL发酵液，以滤纸片上加等量无菌水作为对照。培养条件同1.2。10 d后测量A.caulina菌落直径并计算抑制率。

1.4 菌药相容性测定

将1.2筛选出的杀菌剂配制成浓度为5 μg/mL的含药NA平板，将1.3筛选出的拮抗细菌发酵液稀释105倍，吸取50 μL均匀涂布于NA培养基表面，以加等量无菌水为空白对照，在25℃恒温，L∥D=12 h∥12 h条件下培养48 h，观察菌落生长情况、记录菌落数量并计算抑菌率。

1.5 拮抗细菌LS3的初步鉴定

1.5.1 形态学鉴定

将LS3菌株采用涂布法接种于NA培养基上，参照《植病研究法》［24］和《伯杰氏细菌鉴定手册》［25］直接观察菌落的形态特征;用扫描电镜观察内生细菌LS3的菌体、芽胞形态及大小。

1.5.2 分子生物学鉴定

以细菌基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F和1492R，对菌株的16S rDNA 基因序列进行扩增。反应体系为：模板 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 19.8 μL。扩增程序为：94℃预变性4 min;94℃变性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，循环30次;72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将菌株的16S rDNA序列同模式菌株进行比对分析，选取适宜近缘种相关序列，构建LS3系统发育树。

1.6 拮抗细菌对A.caulina的毒力测定

采用牛津杯法测定［26］。在PDA培养基中心接入预培养7 d的A.caulina病原菌菌饼，在距中心2 cm处的4个位置对称放置一个牛津杯，将筛选出的拮抗细菌发酵液配制成含菌量为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 cfu/mL的菌悬液，取50 μL同一浓度菌悬液加入牛津杯。每处理重复3次。培养条件同1.2。10 d后测量A.caulina菌落直径并计算抑制率，进而计算毒力回归方程、EC50、95%置信限、卡方值。

1.7 拮抗细菌与杀菌剂对A.caulina的联合毒力测定

采用Horsfall法对试验进行设计［27］。根据杀菌剂单剂毒力测定结果，分别配制杀菌剂和拮抗细菌的有效中浓度药液和菌液，分别按V杀菌剂∶V拮抗细菌＝10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10比例混合，将不同配比的混剂和PDA培养基按1∶9混合制成含药培养基，在培养基中心接入预培养7 d的A.caulina菌饼，每处理重复3次。培养条件同1.2。10 d后测量菌落直径并计算抑制率。根据联合毒力测定结果计算增效比（IR），IR≥1为加和作用;IR＜1为拮抗作用，其计算公式：IR= Iob/Ith。式中：Iob为混剂对病原菌的实际抑制率，Ith为混剂对病原菌的理论抑制率，Ith=［ （a+b）ab］/100，a、b 分别代表拮抗细菌和化学药剂以混剂中的质量浓度单独使用时的抑制率。

1.8 助剂及含量筛选

取目标拮抗菌株菌悬液按1%（V/V）的接种量接入200 mL的NB培养基中，并将吐温80、NNO、木质素磺酸钠、十二烷基磺酸钠、聚乙烯比咯烷酮以0.8%（质量分数）含量分别加入到上述NB培养基中，在25℃、160 r/min下振荡培养48 h。吸取50 μL 105倍

发酵稀释液均匀涂布于NA培养基表面，以不加助剂的NB涂布为空白对照。培养条件同1.2。观察菌落生长情况、记录菌落数量并计算抑菌率。

在含拮抗菌的NB培养液中，分别加入质量分数0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%的对拮抗菌抑菌效果最低的助剂，以25℃、160 r/min下振荡培养48 h。吸取50 μL 105倍发酵稀释液均匀涂布于NB培养基表面，以不加助剂的NB为空白对照，25℃恒温，L∥D=12 h∥12 h条件下培养48 h，观察菌落生长情况、记录菌落数量并计算抑菌率。

1.9 菌药复配对藜麦黑茎病的田间防治效果

将筛选出的菌药最佳配比进行田间试验，其中，不同浓度拮抗细菌发酵液分别添加筛选出的最佳含量助剂，测定不同处理对藜麦黑茎病的田间防效，以苯醚甲环唑为对照药剂。试验采用随机区组设计，每个小区为15株长势一致的藜麦植株，每个处理设3个小区。施药方式为常量喷雾。于藜麦成熟初期进行第1次施药，7 d后进行第2次施药，以清水喷雾为对照，14 d后调查发病率和病情指数，计算防治效果。

病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）;

防效=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

按病斑面积占整个茎部面积比例分级，分级标准参照农业农村部农药检定所《农药田间药效试验准则》烟草黑胫病分级标准制定。0级：全株无病;1级：茎部病斑不超过茎围的1/3，个别叶片萎蔫;3级：茎部病斑不超过茎围的1/2，或半数以下叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑;5级：茎部病斑超过茎围的1/2，或半数以上叶片轻度凋萎;7级：茎部病斑环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎;9级：病株全部叶片凋萎或枯死。

1.10 数据分析

采用SPSS 20.0软件中的Duncan氏新复极差法对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 杀菌剂对A.caulina的毒力测定

供试12种杀菌剂中，戊唑醇和咪鲜胺对A.caulina菌丝生长的抑制活性最高（表1），其中在100 μg/mL戊唑醇和咪鲜胺的作用下，A.caulina菌丝无法生长;在10 μg/mL浓度时，戊唑醇和咪鲜胺对菌丝生长的抑制率分别达到91.34%和94.53%，主要用于防治卵菌病害的氟吗啉和甲霜灵对A.caulina菌丝几乎没抑制效果。故选择戊唑醇和咪鲜胺进行室内毒力测定。结果表明，戊唑醇和咪鲜胺对A.caulina的EC50分别为1.78 μg/mL和0.84 μg/mL（表2）。

2.2 拮抗细菌的筛选

以A.caulina为指示菌，从12株供试拮抗细菌中初步筛选出对A.caulina抑制效果较好的4株拮抗细菌LS3、LS5、LS6和LS10，其抑菌率分别为72.10%、72.69%、71.09%和72.16%。复筛显示，LS3、LS5、LS6和LS10的抑菌率分别为61.45%、55.49%、56.12%、60.52%（图1）。

2.3 菌药相容性测定结果

在2种杀菌剂浓度均为5 μg/mL时，戊唑醇和咪鲜胺对LS3的抑菌率分别为6.38%和23.01%，

对LS10的抑菌率分别为16.67%和24.51%，其中对生防细菌抑制率最低的组合为戊唑醇和LS3，故选择戊唑醇和LS3作为最终复配组合。

2.4 拮抗细菌LS3的初步鉴定

2.4.1 形态学鉴定

拮抗细菌LS3培养48 h的菌落呈乳白色或淡黄色不透明，表面无光泽，略微干燥，边缘不规则，菌落正中间较平坦，四周有明显的皱褶突起（图2a）。通过扫描电镜观察，LS3菌体呈长杆状，其大小为（0.5～0.9）μm ×（2.0～3.0）μm（图2b）。

2.4.2 分子生物学鉴定

以LS3基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R对16S rDNA序列进行PCR扩增， 将获得的扩增产物进行测序， 得到大小为1 468 bp的核苷酸序列， 菌株登录号为ON012959。将序列与GenBank 中与部分模式菌株进行对比分析，结果显示LS3与芽胞杆菌属同源，与GenBank中相关菌株16S rDNA序列构建系统发育树，结果（图3）表明，菌株LS3与多个Bacillus sp.菌株序列聚在同一个分支上，因此，拮抗菌株LS3初步鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp.。

2.5 拮抗细菌LS3对A.caulina的毒力测定

由图4可知LS3发酵液浓度在1.32×102～1.32×109 cfu/mL时对A.caulina菌丝生长出现不

同抑制效果，其抑制率在0.79%～73.09%之间，EC50为2.37×105 cfu/mL，95%置信限为9.57×104～5.20×107 cfu/mL，斜率±标准误为（0.427±0.076），χ2=5.913，df=7。

2.6 拮抗细菌与杀菌剂对A.caulina的联合毒力测定

将1.78 μg/mL的戊唑醇与2.37×105 cfu/mL的LS3菌株发酵液以不同体积比复配进行抑菌试验，结果发现，具有加和作用的復配比例为V戊唑醇∶VLS3=6∶4，其实际抑制效果为59.24%，增效比（IR）为1.003＞1（表4），结合杀菌剂与拮抗细菌的相容性试验结果，将V戊唑醇∶VLS3=6∶4作为最佳复配比。

2.7 助剂及其最佳含量筛选

质量分数为0.8%的5种助剂中木质素磺酸钠对LS3菌株影响最小，抑制率仅为1.22%。木质素磺酸钠质量分数分别为1.0%、2.0%、3.0%、5.0% 时，对LS3菌株的抑制率分别为16.06%、31.29%、52.69%，55.41%，木质素磺酸钠质量分数为0.5%时对LS3菌株几乎没有影响（抑制率为-1.15%），因此可以将0.5%的木质素磺酸钠作为助剂应用于田间试验（图5～6）。

2.8 菌药复配对藜麦黑茎病的田间防治效果

菌药不同组合处理田间长势相同的藜麦植株，

各处理藜麦黑茎病发病率不同（表5），与对照小区相比，在1.78 μg/mL戊唑醇和2.37×105 cfu/mL LS3菌株发酵液以体积比6∶4复配时，发病率为9.54%，病情指数为3.34，防效为71.93%，发病率显著低于清水和LS3菌株单剂处理，可作为田间推荐剂量使用。

3 结论与讨论

本研究探索拮抗细菌和杀菌剂复配协同防治藜麦黑茎病的作用。室内毒力测定及田间药效试验结果表明，1.78 μg/mL戊唑醇与2.37×105 cfu/mL枯草芽胞杆菌LS3菌悬液按体积比6∶4配制的复配剂，对Ascochyta caulina抑菌率为59.24%，藜麦黑茎病田间发病率为9.54%，防治效果为71.93%，对藜麦黑茎病病原菌虽然仅仅表现为加和作用，但复配剂与单剂相比，减少了40%戊唑醇使用量。因此，探索生防细菌与杀菌剂协同防治藜麦黑茎病具有重要的指导意义，在稳定防治效果的同时，可减少化学药剂使用量。

在杀菌剂筛选过程中，百菌清、甲霜灵、烯酰吗啉、氟吗啉对A.caulina抑制率较低，可能由于百菌清为保护性杀菌剂，甲霜灵、烯酰吗啉、氟吗啉主要用于防治卵菌病害［28］，因而对A.caulina的抑制作用甚微。值得注意的是，当采用牛津杯法测定拮抗细菌毒力时发现，A.caulina菌落颜色变深，推测可能是由于拮抗细菌的次生代谢产物影响其色素产生造成的，但具体原因还有待深入探究。LS3初步鉴定为芽胞杆菌。目前，已有多项研究表明，芽胞杆菌既能产生生长素、细胞分裂素促进植物生长，又能抑制真菌、细菌、病毒和病原体［2933］。今后可进一步对LS3菌株的抑菌活性物质、生防作用机制，生防制剂的成分配比等进行研究。

冯永新等［34］的研究表明，噻菌铜和短小芽胞杆菌Bacillus pumilus AR03协同防治烟草青枯病，当V噻菌铜∶VAR03=5∶5时，增效比（IR）为1.482。周子燕等［35］的研究表明，多黏类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa和井冈霉素协同防治水稻纹枯病，当V井冈霉素∶V多黏类芽胞杆菌=3∶7时，IR最大，为2.753。谢立等［36］的研究表明，枯草芽胞杆菌Czk1和根康（哈茨木霉·多黏类芽胞杆菌）协同防治橡胶树根病，当V根康∶VCzk1=3∶7时，联合防治橡胶树红根病IR为1.180，联合防治橡胶树褐根病IR为1.510。与已有研究相比较，本研究IR仅为1.003，可能与病原菌在培养基上生长速度较慢有关。但二者复配起到了加和作用，并且减少了杀菌剂40%的使用量。在10倍于单剂EC50的剂量处理下，藜麥黑茎病的发病率仅为6.69%，病情指数为0.74，防效为85.38%。虽然各方面都优于推荐剂量，但是杀菌剂使用量过高也会影响安全性，因此在田间不推荐施用此剂量。

戊唑醇与LS3菌株复配对藜麦黑茎病田间防效显著，与室内毒力测定结果基本一致。但田间试验不确定因素较多，本试验仅为一年结果，为避免试验的偶然性，今后将重复田间试验，以确保试验结果的准确性和科学性。另外，对于戊唑醇和LS3菌株的协同增效作用机制还有待探究，从而为更好地防治藜麦黑茎病提供理论支持。

参考文献

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（责任编辑：杨明丽）