水稻苗床α 萘乙酸药害的生物修复

郑晨曦 程鹏 丁伟

摘要

α萘乙酸廣泛用于水稻秧田调节根系生长，常因用量控制不当造成水稻根系畸形，生长被抑制，地上部叶片变黄等药害大面积发生。从连续定量施用α萘乙酸的土壤中分离获得6株菌株，确定其中2株菌株对α萘乙酸药害具有明显修复作用，经细菌16S rDNA和真菌 rDNAITS鉴定，细菌1号为芽胞杆菌Bacillus sp.，真菌2号为篮状菌Talaromyces sp.。细菌1号和真菌2号菌剂施用后21 d，对苗床土壤中α萘乙酸的降解率分别为56.15%和38.06%;细菌1号处理下，水稻4叶期株高、茎基部宽度、须根数及根系干重分别恢复至对照的84.1%、86.1%、97.7%和84.5%，叶片SOD和POD活性分别显著提高36.4%和66.8%，MDA含量明显降低20.5%;真菌2号处理下，水稻4叶期，株高、茎基部宽度、须根数及根系干物质分别恢复至对照的77.7%、81.6%、92.5%和80.4%。叶片SOD和POD活性分别提高11.1%和74.4%，MDA含量显著降低10.6%。综上，细菌1号和真菌2号对水稻苗床α萘乙酸药害具有显著修复效果。

关键词

水稻; α萘乙酸; 药害; 降解; 生物修复

中图分类号：

S 482.84; S 481.8

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022084

Bioremediation of αnaphthylacetic acid damage in rice seedbeds

ZHENG Chenxi1， CHENG Peng2， DING Wei1*

（1. College of Agriculture， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China;

2. Heilongjiang Agricultural Technology Extension Station， Harbin 152500， China）

Abstract

Alphanaphthalene acetic acid is widely used in rice seedling fields to regulate root growth， often causing root deformities， growth inhibition and aboveground leaf yellowing due to improper dosage control. Six microbial strains were isolated from soil under continuous quantitative application of αnaphthylacetic acid， and two of them were determined to have significant remediation effect on αnaphthylacetic acid damage， identified by 16S rDNA and rDNAITS as Bacillus sp. （Bacteria 1） and Talaromyces sp. （Fungus 2）. The degradation rate of αnaphthylacetic acid in the soil of the seedbed by Bacteria 1 and Fungus 2 was 56.15% and 38.06% 21 days after applications， respectively. The plant height， stem basal width， fibrous root number and root dry weight of rice at the 4leaf stage recovered to 84.1%， 86.1%， 97.7% and 84.5% of the control under Bacterial 1 treatment， and leaf SOD and POD activity were significantly increased by 36.4% and 66.8%， and the MDA content was obviously reduced by 20.5%. At the 4leaf stage of rice under Fungus 2 treatment， plant height， stem basal width， number of fibrous roots and root dry matter recovered to 77.7%， 81.6%， 92.5% and 80.4% of the control， respectively. Leaf SOD and POD activities were increased by 11.1% and 74.4%， respectively， and MDA content was significantly reduced by 10.6%. It suggested that Bacteria 1 and Fungus 2 had significant restoration effect on αnaphthalene acetic acid damage in rice seedbeds.

Key words

rice; αnaphthylacetic acid; drug damage; degradation; bioremediation

20世纪90年代以来，水稻旱育稀植技术在中国水稻产区开始大面积推广应用。化控剂在促进水稻旱育秧苗根系生长、预防病害和改善水稻生理特性等方面发挥了重要作用［12］。α萘乙酸是一种人工合成的生长素类似物，在促进水稻秧苗根系生长方面发挥着重要的作用。由于其价格低廉，性质稳定，已被广泛应用于水稻生产［3］。研究表明，α萘乙酸浓度在 0～0.01 mg/L范围内，水稻根的伸长生长随浓度增加而加快，不定根数量略有增加;当α萘乙酸浓度超过 0.1 mg/L后，根的伸长生长明显受到抑制［4］。α萘乙酸应用于树木扦插时也表现为低促高抑［5］。以 400～500 mg/kg α萘乙酸溶液浸泡枝條，插条生根率可达到 83%以上;α萘乙酸浓度增加到600 mg/kg时虽然能明显促进插条基部愈伤组织的形成，但其生根率反而下降。高浓度α萘乙酸处理的插条，由切口向上逐渐变褐、腐烂，只有部分插条能够生根成活［6］。在水稻生产过程中，农户对α萘乙酸用量控制不当，未按照说明书要求用量施用，习惯性加大用量来达到壮秧目的，但由于植物生长调节剂与除草剂等农药不同，属于超高活性药剂，低浓度α萘乙酸可促进植物生根，而高浓度α萘乙酸则抑制植物生长［7］。苗床土壤中高浓度α萘乙酸导致秧苗根系畸形、叶片变黄，大部分秧苗因不能正常吸收水分和养分而死亡［8］。因此本研究以α萘乙酸在水稻育秧田中最适浓度的3倍量模拟高剂量α萘乙酸对水稻秧苗产生药害进行生物修复探究。

农药施用于植株，仅10%～20%农药附着在植株上，剩余80%～90%中大部分落入土壤、小部分进入地下水及空气中，而微生物对水和土壤中的农药降解起主要作用［9］。α萘乙酸在土壤中的降解方式包括光解、水解和微生物降解［10］。对于残留于土壤中的α萘乙酸，大多可以通过微生物降解的方式消除。因此，利用微生物降解作用修复其残留药害是操作简便且不会产生二次污染的有效方法。目前国内外科研工作者多是对除草剂残留的生物降解进行研究［1113］，对水稻秧田过量施用α萘乙酸造成药害的生物修复鲜有报道。本研究采集人迹罕至的林地土壤，室内连续定量添加α萘乙酸进行培养，筛选对α萘乙酸药害修复效果较好的菌株。

对分离和鉴定的2株可降解α萘乙酸的优势菌株，以过量施用α萘乙酸的药害水稻秧苗作为指示植物，测定其对α萘乙酸的降解和对药害水稻秧苗的修复效果，为解决水稻旱育秧过程中α萘乙酸药害提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻为 ‘东富125，种子由东北农业大学农学院水稻育种室提供。供试土样采自人迹罕至未施用任何农药的林地内。98% α萘乙酸粉剂，东北农业大学农学院农药学科农药生态安全实验室提供。

马丁氏培养基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氢钾 1 g，硫酸镁 0.5 g，琼脂 20 g，1/3 000孟加拉红溶液 100 mL，蒸馏水定容至1 000 mL，氯霉素 0.1 g。

细菌培养基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 15～25 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.4～7.6。

PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.3。

1.2 α萘乙酸降解菌的筛选与鉴定

1.2.1 α萘乙酸降解菌的富集与分离

取过筛林地土2 kg，分4次按剂量0.1、0.2、0.4、0.8 g/kg加入α萘乙酸;每次加入α萘乙酸后，于25～28℃恒温培养箱中培养7 d，共计培养28 d。期间适量喷水，保持土壤湿润。

取培养好的土样1 g加入到9 mL 无菌水中，充分混合均匀后用无菌水依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的浓度梯度用于菌株分离。用灭菌接种环分别蘸取10-6、10-7、10-8、10-9浓度土壤溶液，涂布到细菌培养基和马丁氏培养基平板上，3次重复，分别于37℃ 和 28℃ 培养箱中培养，待平板上出现单菌落后挑取单菌落进一步纯化;将分离的菌株于试管斜面培养基中 4℃ 保存。

1.2.2 菌株鉴定及发育树的构建

将细菌1号菌株接种于LB液体培养基30℃培养12 h，采用BigDye Teminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit（天根生化科技有限公司）提取细菌基因组DNA。采用细菌16S rDNA通用引物对［14］（27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′;1492R：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′）扩增，片段大小为1 500 bp。PCR反应体系（20 μL）：DNA 模板1 μL，Big Dye 8 μL，正、反向引物（10 μg/L）各0.5 μL，dd H2O 10 μL。PCR反应程序：96℃ 预变性 5 min;96℃ 变性 20 s，62℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，35个循环;72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

真菌2号菌株活化后转接到PDA平板中，待菌丝长满培养皿后，采用Sangon生物有限公司的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（Genomic DNA Purification Kit）提取DNA。采用真菌rDNAITS通用引物对（ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′;ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）扩增，片段大小为500 bp。PCR反应体系（30 μL）：Super Mix 15 μL， DNA模板1 μL， ITS1（10 μg/L）1 μL， ITS4（10 μg/L）1 μL，ddH2O补足至30 μL。PCR反应程序：96℃ 预变性 5 min;96℃ 变性 20 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，35个循环;72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

使用PCR产物磁珠法纯化试剂盒（上海硕美生物科技有限公司）纯化PCR产物，纯化产物送北京六合华大基因科技有限公司测序。测序结果上传至NCBI数据库，在GenBank中通过BLAST进行同源性比对，通过MEGA X软件进行系统发育分析，采用neighborjoining 法构建系统发育树。

1.3 土壤中α萘乙酸与根长抑制率的关系曲线

采用生物测定法［15］建立标准曲线。将采集的土样经自然风干，过筛去除杂质后备用。将供试水稻种子浸泡催芽，待种子露白后备用。将α萘乙酸均匀混入土样中，配制成0、0.003 1、0.006 3、0.012 6、0.025 0、0.050 0、0.100 0 g/kg （有效剂量）系列浓度梯度，将不同浓度药土50 g装入纸杯中，每纸杯播种10粒刚露白的水稻种子，以α萘乙酸浓度为0的处理作为对照，每处理重复3次。将纸杯放入昼/夜28.5℃/20℃，L∥D=12 h∥12 h的培养箱中培养，在培养后的第10天测量根长，计算根长抑制率，建立根长抑制率与α萘乙酸浓度之间的标准曲线。

根长抑制率=（对照根长-处理根长）/对照根长×100%。

1.4 α萘乙酸对水稻苗期生长的影响及菌剂对α萘乙酸的降解

田间试验在东北农业大学园艺站大棚内进行，4月－5月平均最高气温18.16℃。采用随机区组设计，共设8个处理（表1），为防止肥料对菌剂修复效果产生干扰，试验过程中未施入任何肥料。以α萘乙酸最适浓度的3倍浓度0.05 g/kg（有效剂量，下同）施用于育秧土中模拟水稻育秧过程中施用的过量浓度。将供试98%α萘乙酸与过筛育秧土均匀混合配制成药土。浇透底水后播种，每处理6次重复，以不施药和只施用α萘乙酸土壤做对照。水稻出苗后按表1施用分离菌株培养的菌剂，菌剂浓度为108 cfu/mL。

1.4.1 菌剂对α萘乙酸的降解

在施用菌剂后7、14、21、28 d分别取育秧土装入纸杯，每纸杯播种10粒刚露白的水稻种子，按1.3的方法测定根长抑制率，根据标准曲线计算出土壤中α萘乙酸残留，进而计算α萘乙酸的降解率。试验重复3次。

α萘乙酸自然降解率=（α萘乙酸施用濃度－单施α萘乙酸处理组土壤残留浓度）/α萘乙酸施用浓度×100%；

菌剂对α萘乙酸的降解率=（单施α萘乙酸处理组土壤残留浓度－菌剂处理组土壤中α萘乙酸残留浓度）/α萘乙酸施用浓度×100%。

1.4.2 菌剂对水稻苗期生理指标及干物质积累量的影响

田间水稻生长至2.5 叶期和 4 叶期时，分别测定水稻株高、须根数、茎基部宽度、百株地上部及根系干重。茎基部宽度采用游标卡尺测定，干重采用烘干法测定，105℃杀青30 min，60℃烘干至恒重。

1.4.3 菌剂对水稻秧苗SOD、POD活性和MDA含量的影响

取水稻2.5叶期和4叶期叶片，放入装有冰袋的保温箱立即带回实验室，测定抗逆酶活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［16］。其中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮蓝四唑光化还原法测定；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚法测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定。

1.5 数据处理与分析

采用Excel 2019和SPSS 20软件进行数据处理和统计分析，数据均为平均值±标准差，采用单因素和Duncan氏法进行5%水平下方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂对水稻秧苗生理指标的影响

6个微生物菌剂施用后，与仅施用α萘乙酸的处理2相比，水稻株高、茎粗、须根数及根系干重均有不同程度的变化，其中以细菌1号处理的修复效果最佳，真菌2号处理次之。与未施用任何药剂的处理1相比，细菌1号施用后，在水稻2.5叶期，株高、茎基部宽度、须根数分别恢复至对照的80.8%、78.3%和81.2%;4叶期，分别恢复至空白对照（T1）的84.1%、86.1%和97.7%;4叶期根系干重恢复至对照的84.5%。真菌2号处理，水稻2.5叶期，株高、茎基部宽度及须根数和根系干重分别恢复至空白对照（T1）的74.9%、73.7%、97.3%和78.6%；4叶期分别恢复至对照的77.7%、81.6%、92.5%和80.4%。真菌1号和其他细菌处理水稻秧苗均未能显著恢复正常。结果表明：细菌1号与真菌2号可明显修复α萘乙酸药害下水稻秧苗的生长（表2和表3）。

2.2 微生物菌剂对水稻秧苗抗逆酶活性的影响

细菌1号处理，与单施α萘乙酸处理（T2）相比，4叶期水稻叶片SOD和POD活性分别显著提高36.4%和66.8%，MDA含量明显降低20.5%;真菌2号处理，与单施α萘乙酸处理（T2）相比，4叶期水稻叶片SOD和POD活性分别提高11.1%和74.4%，MDA含量显著降低10.6%。真菌1号和其他细菌处理对水稻秧苗抗逆酶活性无显著影响（图1～3）。

2.3 微生物菌剂对α萘乙酸的降解

土壤中α萘乙酸的浓度与根长抑制率的关系可以用多项式模型很好地拟合出来（图4）。施用微生物菌剂后7 d取样测定结果表明：细菌1号和真菌2号对α萘乙酸的降解率分别为31.90%和12.53%，与单施α萘乙酸的处理2相比差异达显著水平，其他菌剂与处理2相比差异不显著;菌剂施用后21 d，细菌1号和真菌2号对α萘乙酸降解率分别为56.15%和38.06%，与处理2相比差异显著，其他菌剂处理对α萘乙酸的降解率显著低于处理2（图5）。

2.4 α萘乙酸降解菌的分離与纯化

逐步提高土壤中α萘乙酸的施用量后，经过连续5次继代培养，分离得到6株菌株，其中真菌2株，细菌4株，菌落形态见图6。对筛选出的α萘乙酸降解效果好的两株菌株细菌1号和真菌2号进一步连续纯化培养3次后，细菌菌落呈黄色、圆形、隆起、不透明、边缘整齐（图7）。真菌菌落呈灰绿色，圆形，密毡状（图8）。

2.5 α萘乙酸降解菌的鉴定

真菌2号和细菌1号菌株对α萘乙酸降解效果较好，分别对其进行rDNAITS和16S rDNA分子鉴定，并将两菌株的基因序列上传至NCBI进行BLAST比对并构建系统发育树，结果显示，真菌2号与篮状菌属的尖海龙类共附生真菌Talaromyces amestolkiae（NR120179）的rDNAITS的相似性较高，为95%，聚在同一个分支（图9），因此，将真菌2号鉴定为篮状菌Talaromyces sp.。细菌1号与芽胞杆菌属的太平洋芽胞杆菌Bacillus pacificus（CP041979）的16S rDNA序列的相似性较高，为90%，聚类于同一个分支（图10），因此，将细菌1号鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp.。

3 结论与讨论

α萘乙酸在水稻旱育秧田应用时，常因低温条件和施用浓度人为增加而造成水稻秧苗药害的发生。对于药害较轻的田块，可通过叶片冲洗，及时松土提高土壤通透性，结合灌水和适当施用一些速效肥料等恢复生长或利用其他生长调节剂缓解药害［17］。然而，药害较重的地块上述方法很难达到药害的修复效果。

利用微生物的降解作用可在药害发生后快速降解药剂，从而实现快速恢复药害作物生长的实际效果。目前已经陆续分离出能够降解各类植物生长调节剂的微生物菌株［18］，且对降解细菌的研究较为深入［19］。现阶段对微生物降解植物生长调节剂的研究主要是在培养基中的研究，培养基中发生的降解行为与土壤中仍有不同。本文通过分离可降解α萘乙酸的菌株来缓解其产生的药害，细菌1号和真菌2号施用于水稻育秧田21 d后对α萘乙酸的降解率分别为56.15%和38.06%，贪铜菌Cupriavidus sp. CY1在含300 mg/L 2，4D的培养基中48 h内可降解100%的2，4D，在100 mg/kg 2，4D的土壤中，3 d内能降解90%的2，4D［20］。不同菌种对同一植物生长调节剂的降解也有差异。如在含100 mg/L多菌灵的液体培养基中，其他条件相似的情况下，红球菌 Rhodococcus sp.在48 h内可以降解74%的多菌灵［21］，而短小芽胞杆菌 Bacillus pumilus在24 h内就可以降解83.6%的多菌灵［22］。有关环境因素与农药残留量的相关性研究还较少。本研究对α萘乙酸在土壤中的降解微生物进行筛选和验证，同时也进行了α萘乙酸降解菌株的降解效果初探，但尚缺乏培养基条件下降解菌株对α萘乙酸的降解试验及探究其降解过程中的代谢产物等降解机制方面的研究。

此外，本研究分离的细菌1号和真菌2号

对过量施用α萘乙酸后的水稻株高、次生根条数、茎基部宽度及地上部、根系干物质积累等生理指标都表现出很好的修复效果。但是只对两种微生物降解菌单独施用进行了研究，且施用剂量未做浓度梯度处理，仅按照微生物菌株田间施用量进行试验，虽有很好的修复效果，但未对水稻生长起到促进作用。并且农田生态系统具有多样性、复杂性和不确定性，因此，还应进一步深入研究两种菌株与环境条件互作下对α萘乙酸的降解效果，并明确两种降解菌对水稻秧苗α萘乙酸药害修复的最适浓度，为这两种菌株合理应用提供更可行方案。

本研究分离获得对α萘乙酸降解效果较好的尖海龙类共附生真菌和太平洋芽胞杆菌，对水稻α萘乙酸药害具有明显的修复效果。

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