卵孢小奥德蘑蛛网病病原菌的鉴定与生物学特性研究

李俊 秦文韬 高琳 刘宇 王守现 宋庆港

摘要

卵孢小奧德蘑Oudemansiella raphanipes是近年来成功驯化栽培的一种食药兼用的珍稀菌类，近年来随着其栽培面积的不断扩大，病害发生也越来越严重。作者在北京某卵孢小奥德蘑种植基地发现疑似蛛网病，为明确其病原菌，对发病子实体进行了病原菌分离，并综合其形态学特征、多基因系统发育分析和柯赫氏法则验证的结果，将卵孢小奥德蘑蛛网病病原菌鉴定为金黄菌寄生Hypomyces aurantius（无性阶段为异形枝葡霉Cladobotryum varium）。该病原菌菌丝生长的最适温度为20℃，最适碳源为木屑，最适氮源为黄豆粉，最适pH为6，光照对菌丝生长有一定的抑制作用;产孢最适温度为20℃，最适pH为8，最适氮源为麸皮，最适碳源为木屑;孢子萌发的最适营养液为0.2%葡萄糖溶液，最适温度为25℃，最适pH为6。研究结果为进一步明确卵孢小奥德蘑蛛网病的发生规律，制定科学的防治策略奠定了基础。

关键词

卵孢小奥德蘑; 蛛网病; 金黄菌寄生; 生物学特性

中图分类号：

S 436.46

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022183

Identification and biological characteristics of Hypomyces aurantius， the pathogen of cobweb disease on Oudemansiella raphanipes

LI Jun1，2， QIN Wentao1*， GAO Lin1， LIU Yu1*， WANG Shouxian1， SONG Qingang1

（1. Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom， Institute of Plant Protection， Beijing Academy of

Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China; 2. College of Bioscience and Resources Environment，

Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China）

Abstract

Oudemansiella raphanipes， one of rare fungi for both food and medicine， has been successfully domesticated and cultivated in recent years. With the expansion of the cultivation area， various diseases appear on O.raphanipes. Suspected cobweb disease was found in a planting base of O.raphanipes in Beijing. The pathogen was isolated from the diseased fruiting body and identified as Hypomyces aurantius（anamorph was Cladobotryum varium）by integrated method of morphological characteristics， multigene phylogenetic analysis and Kochs rule verification. Biological characteristics analysis showed that the optimum temperature for mycelial growth of H.aurantius was 20℃， the optimum carbon source was sawdust， the optimum nitrogen source was soy flour， and the optimum pH value was 6， while light showed a certain inhibitory effect on the mycelial growth. The optimum temperature for spore production was 20℃， the optimum pH value was 8， the optimum nitrogen source was bran and the optimum carbon source was sawdust. The optimum nutrient solution for spore germination of H.aurantius was 0.2% glucose solution， the optimum temperature was 25℃， and the optimum pH value was 6. The results will lay foundations for further clarifying the occurrence regulation of the disease and formulating scientific control strategies.

Key words

Oudemansiella raphanipes; cobweb disease; Hypomyces aurantius; biological characterization

卵孢小奥德蘑Oudemansiella raphanipes （Berk.） Pegler & T.W.K. Young商品名为黑皮鸡枞，隶属于担子菌门Basidiomycota，伞菌纲Agaricomycetes，伞菌目Agaricales，膨瑚菌科Physalacriaceae，小奥德蘑属Oudemansiella［1］，其子实体口感独特，含有丰富的氨基酸、蛋白质、脂肪酸、多糖、膳食纤维等营养成分，并具有抗氧化、保护肝脏、调整肠道菌群、缓解内毒素血症、抗肿瘤、降血压、抑制病原菌的生物活性［2］，是食药兼用的高档保健珍稀菌类。卵孢小奥德蘑首次发现于印度，在我国人工栽培时间较短［35］，据中国食用菌协会统计，2020年全国卵孢小奥德蘑总产量达19 502 t，且已在山东、山西和广东等多个地区形成了一定的栽培规模。覆土是卵孢小奥德蘑生产过程中的关键步骤，复杂的生长环境为病害的发生提供了便利条件，因此，近年来，随着其栽培面积的不断增加，病害的发生也越来越重，限制了卵孢小奥德蘑的健康生长及其产业的发展。

2021年，作者在北京某食用菌种植基地发现卵孢小奥德蘑子实体上的一种病害，疑似蛛网病，为明确其病原，本研究综合形态学特征、培养特性及多基因系统发育分析，明确其分类地位，并完成柯赫氏法则验证，进一步研究并明确了病原菌的生物学特性，以期为进一步理解卵孢小奥德蘑蛛网病的发生规律，制定科学的防治措施提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离与纯化

利用无菌接种针挑取适量罹病的卵孢小奥德蘑子实体上的白色霉状物于PDA综合培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 0.5 g，维生素B1 10 mg，蒸馏水1 000 mL）上，置于培养箱中25℃恒温黑暗培养，逐日观察并记录菌株的培养特性（生长速度、菌落颜色变化及产孢情况）。待菌落产孢后，进行单孢分离纯化，获得纯培养菌株，并保藏于北京市农林科学院植物保护研究所病原菌资源库内，菌株编号为FSA2。

1.2 病原菌的形态学鉴定

用直径5 mm的打孔器打取菌块，接种到PDA综合培养基上，置于25℃恒温培养箱内黑暗条件下培养，逐日观察记录菌丝生长状况和菌落形态。利用光学显微镜观察菌丝、分生孢子及厚垣孢子的形态特征，测量40个分生孢子的大小，并对上述特征进行拍照。

1.3 病原菌多基因序列分析

将分离菌株接种至PDA综合培养基上，置于25℃恒温培养箱中黑暗培养7 d，刮取適量菌丝于已灭菌的1.5 mL离心管中，利用植物基因组DNA提取试剂盒（北京，天根），按照说明书步骤进行基因组DNA的提取，并分别利用引物ITS1/ITS4［6］，EF1983F/2218R［7］，RPB25F/7cR［8］扩增ITS、TEF1α、RPB2基因，利用自设计引物RPB1F1（5′GCCGATGAAGTTGGTCTA3′）/RPB1R1（5′TATGTTGCGGTGAGCCTT3′）扩增RPB1基因。PCR反应总体系（20 μL）：引物各1.0 μL，PCRMix（北京，擎科）10 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。ITS、TEF1α、RPB2的PCR反应条件参考上述相应文献。RPB1基因扩增反应条件：95℃预变性5 min;95℃变性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至中美泰和生物技术有限公司（北京）测序。将测得的序列在GenBank数据库中进行BLAST分析，同时，基于ITS、RPB1、RPB2和TEF1α序列，利用PAUP 4.0b10软件采用最大简约法（maximum parsimony，MP）构建多基因系统发育树，Bootstrap重复检验次数为1 000次［9］。在系统发育树中，最大简约分析的自展值（bootstrap value，BP）大于50%的显示于各分支的节点上。

1.4 致病性测定

利用柯赫氏法则验证菌株FSA2对卵孢小奥德蘑的致病性。在可控智能出菇箱中培养卵孢小奥德蘑，待出菇后进行回接试验。配制浓度为108个/mL的孢子悬浮液，并将其喷洒于健康卵孢小奥德蘑子实体上，以喷洒等量无菌水作为对照，每处理重复3次，出菇箱温度控制在24～26℃，相对湿度控制在80%～90%;定期观察子实体的发病情况，并与自然发病症状进行比较，回接试验重复4次。发病后，重新分离获得病原菌纯培养菌株，并鉴定其是否为同一病原菌。

1.5 病原菌生物学特性研究

1.5.1 温度对病原菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

温度对菌丝生长的影响：将直径为5 mm的菌块接种在直径为90 mm的PDA综合培养基平板上，分别置于15、20、25、30、35℃下恒温黑暗培养，每个处理重复4次，每天观察记录菌落的生长情况，采用十字交叉法测量菌落直径，并重点对72 h后数据进行记录分析。

温度对菌株产孢量的影响：将菌株在25℃黑暗条件下培养5 d，取菌落边缘直径5 mm的菌块接种于PDA综合培养基平板中央，3次重复，分别置于上述梯度温度条件下进行恒温培养。7 d后每皿取4块直径1 cm的菌块，用1 mL无菌水洗脱孢子，血球计数板测定产孢量，每个处理重复3次。

温度对孢子萌发的影响：用移液枪分别吸取15 μL 的0.2%葡萄糖溶液滴在单凹玻片上，并滴加15 μL浓度相同的孢子悬浮液，置于上述梯度温度条件下进行恒温保湿培养，24 h后观察记录孢子萌发情况。每处理观察200个孢子萌发情况，每处理重复3次。芽管长度超过孢子直径长度（指直径最小的一边）的一半视为已经萌发。分生孢子萌发率=萌发的孢子数/孢子总数×100%。

1.5.2 pH对病原菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

利用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节PDA综合培养基及0.2%葡萄糖溶液的pH，分别设置培养基和葡萄糖溶液的pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5和8，培养基灭菌后制作平板，然后将直径为5 mm的菌块接种于直径90 mm培养基平板上;其余方法同1.5.1。

1.5.3 碳源对病原菌菌丝生长、产孢量的影响

以PDA综合培养基为对照，分别以等量碳源的棉籽壳、玉米芯、木屑、蔗糖、麦芽糖、淀粉替代葡萄糖;其余方法同1.5.1。

1.5.4 氮源对病原菌菌丝生长、产孢量的影响

以PDA综合培养基为对照，分别以等量氮源的麸皮、黄豆粉、玉米粉、酵母粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠替代蛋白胨;其余方法同1.5.1。

1.5.5 光照对病原菌菌丝生长的影响

将直径为5 mm的菌块接种在PDA综合培养基上，置于25℃恒温培养箱中，分別设置完全光照和完全黑暗两个处理;其余方法同1.5.1。

1.5.6 不同营养液对病原菌孢子萌发的影响

用移液枪分别吸取15 μL的0.2%葡萄糖溶液、0.2% α乳糖溶液、0.2%蔗糖溶液、0.2%麦芽糖溶液在单凹玻片上，并滴加15 μL浓度相同的孢子悬浮液，置于25℃恒温培养箱中保湿培养，24 h后观察记录孢子萌发情况。每处理观察200个孢子萌发情况，重复3次。

2 结果与分析

2.1 病害症状调查

卵孢小奥德蘑蛛网病发生初期表现为灰白色蛛网状的菌丝首先出现在土壤表层，并逐渐扩展至菌柄基部，向上逐渐蔓延至菌褶甚至菌盖，最后完全覆盖包裹子实体，导致20%以上的子实体失去商品价值，经济损失严重（图1a， b）。

2.2 病原菌形态学鉴定

病原菌在PDA培养基上生长较迅速，25℃黑暗培养3 d后，菌落直径可达30～60 mm，菌落白色，气生菌丝丰富，且有黄色色素扩散至培养基中（图2a）。菌丝致密且具有隔膜，分生孢子梗呈帚状或轮枝状分枝（图2c）;分生孢子椭圆形至长椭圆形，透明，具有0～1个分隔，大小为（11.1～18.75）μm×（6.5～9.2）μm（图2b），厚垣孢子顶生、间生或2～4个串生（图2d）。根据菌落及显微形态特征，鉴定该病原菌为金黄菌寄生Hypomyces aurantius［10］。

2.3 病原菌分子鉴定

测序获得菌株FSA2的ITS、TEF1α、RPB2和RPB1序列，通过BLAST分析发现菌株FSA2的上述基因序列分别与Hypomyces aurantius的模式菌株TFC 95171基因序列（FN 859425、FN 868743、FN 868679和FN 868805）的相似度大于98%。构建基于上述基因的系统进化树结果显示，菌株FSA2以高自展值与Hypomyces aurantius模式菌株TFC95171聚成一簇（MPBP=100%）（图3）。综合形态学特征、培养特性和分子生物学鉴定结果，确定该病原菌为金黄菌寄生Hypomyces aurantius。

2.4 致病性测定

将菌株FSA2的孢子悬浮液接种至健康的卵孢小奥德蘑子实体上2 d后，覆土表面出现大量灰白色菌丝体，并逐渐向菌柄基部及菌柄上部扩展，3～5 d后逐步覆盖子实体，部分发病的子实体菌柄有脱皮开裂扭曲现象，部分发病子实体生长后期开伞后，菌盖或菌柄上会产生棕色至深褐色病斑（图4c～f），人工接种病原菌后卵孢小奥德蘑的发病症状（图4b）与田间自然发病症状一致，对照组未出现发病迹象且长势良好（图4a）。从人工接种的发病卵孢小奥德蘑子实体上再次分离病原菌并进行鉴定，得到了与接种真菌相同的病原菌，因此确定菌株FSA2为卵孢小奥德蘑蛛网病的病原菌。

2.5 病原菌生物学特性

2.5.1 温度对病原菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

病原菌在15～25℃的温度范围内均可正常生长，15℃下菌落较稀疏，20～25℃下菌落生长速度较快，菌丝较致密，20℃下长势最好，培养72 h后菌落直径为（6.19±0.62）cm，当温度高于30℃时，菌丝生长速度极缓慢，24 h后停止生长。最适产孢温度为20℃，7 d产孢量为5.8×106个/mL，通过对孢子最适萌发温度的研究，25℃最适合孢子萌发，24 h萌发率可达62.24%（表1）。

2.5.2 pH对病原菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

病原菌在pH 5～8的范围内均可正常生长，pH 5～6的范围内病原菌长势较好。pH为6时，长势最好，培养72 h菌落直径为（6.74±0.22）cm。当pH＞7时，菌丝生长缓慢，pH为7时，直径最小，仅为（5.91±0.85）cm。pH为5.0～8.0时，产孢量逐渐增加，pH为8时，产孢量最高，7 d产孢量可达7.1×105个/mL，但在24 h萌发率较低，仅为9.05%，pH为6.5时，孢子可以较好萌发，24 h的萌发率为82.58%，显著高于前者。

2.5.3 碳源对病原菌菌丝生长、产孢量的影响

在6种不同碳源的培养基中（表3），病原菌菌丝均可以生长，但病原菌对不同碳源的利用能力存在较大差异。在以木屑为碳源的培养基上病原菌菌丝生长最快，25℃培养72 h后菌落直径为（6.35±0.54）cm，玉米芯次之，而在以蔗糖为碳源的培养基上，菌落长势缓慢，25℃培养72 h后菌落直径为（4.25±1.04）cm，菌落直径小于对照组，葡萄糖为碳源培养72 h后菌落直径为（4.55±0.37）cm。以木屑为碳源时产孢量最大，7 d产孢量可达到6×106个/mL。

2.5.4 氮源对病原菌菌丝生长、产孢量的影响

在7种不同氮源的培养基中（表4），病原菌均可正常生长，但病原菌对7种氮源的利用能力存在较大差异，其中对黄豆粉的利用能力较高，病原菌在以黄豆粉作为氮源的培养基上长势最好，25℃生长72 h后菌落直径为（5.7±0.63）cm，麸皮次之，且病原菌在以麸皮作为氮源的培养基上的菌落直径与对照组（蛋白胨）不存在显著差异，病原菌对硝酸钠和尿素的利用能力较差，生长速度缓慢，25℃培养72 h菌落平均直径分别为（2.33±0.42）cm和（3.24±0.32）cm。同时，在以麸皮为氮源的培养基上病原菌产孢量最大，7 d产孢量为1.6×106个/mL。

2.5.5 光照对病原菌生长的影响

病原菌在光照和黑暗条件下均可以正常生长，但是在两种条件下，病原菌的生长速率存在差异，25℃黑暗条件下恒温培养72 h后病原菌菌落直径为（4.94±0.10）cm，而光照条件下的菌落直径为（4.16±0.54）cm，说明光照对病原菌生长有一定的抑制作用。不同条件下病原菌菌落颜色稍有差异，黑暗条件下菌落颜色呈白色至淡黄色。

2.5.6 不同营养液对病原菌孢子萌发的影响

24 h后在显微镜下观察孢子的萌发情况，发现孢子在蔗糖溶液中不萌发，在0.2%麦芽糖和0.2% α乳糖溶液中萌发率均低于20%;在0.2%葡萄糖溶液中萌发率最高，为62.24%，显著高于在其他营养液中的孢子萌发率（图5）。

3 结论与讨论

菌寄生属真菌无性阶段隶属于枝葡霉属，是一类常见的病原真菌，作为食用菌蛛网病的病原已报道可危害双孢菇Agaricus bisporus、香菇Lentinula edodes、杏鲍菇Pleurotus eryngii、金针菇Flammulina filiformis等多种食用菌，在中国、韩国、南非等国家和地区均造成了严重的经济损失［1112］，被认为是最具毁灭性的食用菌病原真菌之一［13］。20世纪90年代，双孢菇蛛网病曾在爱尔兰与英国流行，造成子实体减产近40%［14］。

本文综合了田间发病症状、致病性测定结果、形态学鉴定及分子生物学鉴定结果，明确在卵孢小奥德蘑子实体上发现的病害为蛛网病，病原菌为金黄菌寄生Hypomyces aurantius。该病原菌侵染卵孢小奥德蘑时首先在土壤表面出現大量灰白色菌丝，并逐渐扩展至子实体的菌柄，而后蔓延到菌盖，侵染过程中部分菌柄会出现表皮脱落开裂的现象，最后病原菌菌丝会覆盖整个子实体，导致子实体腐烂甚至死亡，症状与香菇、双孢菇等其他食用菌蛛网病的症状相似［1517］。刘国丽等［18］在辽宁地区发现了卵孢小奥德蘑蛛网病，但病原菌尚未鉴定到种，且与本研究菌株的系统发育位置存在差异。

本文通过对卵孢小奥德蘑蛛网病病原菌生物学特性的研究，明确了其在不同环境条件下的适应能力及对不同营养源的利用情况，可为进一步研究病害发生规律与环境因素之间的关系，制定高效的综合防控策略提供理论依据。本研究发现，病原菌菌丝的最适生长温度为20℃，最适pH为6.0，光照对菌丝体的生长有一定的抑制作用。作为真菌，卵孢小奥德蘑菌丝与其蛛网病病原菌的适宜生长温度和pH类似［5］，本研究还发现当温度高于30℃时，卵孢小奥德蘑蛛网病病原菌菌丝生长速度极缓慢，甚至24 h后停止生长，可为今后生态防治该病害提供参考，在生产结束后建议对生产场所进行高温闷棚及晾晒处理，降低病原菌基数，减少病害的发生。此外，现有生物学特性的研究主要针对叶枝葡霉Cladobotryum mycophilum，树状枝葡霉C.dendroides与异形枝葡霉3个种［11，15］，它们对碳氮源的利用能力不同，其中异形枝葡霉的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨［19］，本研究充分考虑实际生产中卵孢小奥德蘑对有机碳源、氮源的利用能力，在前人研究的基础上测试了多种有机碳源、氮源对卵孢小奥德蘑蛛网病病原菌生长的影响，结果显示，木屑为最适碳源，黄豆粉为最适氮源。黄慧等［20］对羊肚菌菌盖干腐病病原菌长孢卵单隔孢霉Diploospora longispora的培养特性研究发现，其最适氮源为蛋白胨与硝酸铵，最适碳源为葡萄糖与麦芽糖，菌丝生长及孢子萌发最适温度为15～25℃，最适pH为6～10;当温度超过30℃菌丝即停止生长，孢子无法萌发。病原菌的孢子数量及萌发情况直接影响病害的发生及其危害程度，因此对病原菌进行鉴定的同时，探索其孢子形成与萌发条件也非常关键，可以从调控孢子形成与萌发的角度为研究病害防治新方法提供理论依据。在卵孢小奥德蘑生产过程中，应综合考虑寄主与病原菌的营养偏好，预防和控制蛛网病的发生。

蛛網病可危害双孢菇、香菇、杏鲍菇、金针菇、卵孢小奥德蘑等多种食用菌，因此，在上述食用菌栽培过程中，应高度关注其病原菌的动态变化，坚持预防为主、综合防治的原则，严格把控生产的各个环节，合理调控棚内环境条件，严防蛛网病的发生，降低生产损失。食用菌和蛛网病病原菌同属真菌范畴，且二者对药剂的敏感程度相似，要求化学防控药剂具有较高的选择性，但目前已登记可用于食用菌生产的防控投入品较少［21］，可用于食用菌病害防控的药剂更有限［22］，苯菌酮在国外已登记且在防控食用菌蛛网病过程中效果良好［23］，因此，国内应加快苯菌酮药剂的登记及蛛网病防控药剂的研发工作。本文研究结果为食用菌蛛网病的科学防治奠定了理论基础。

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（责任编辑：杨明丽）