吉林和黑龙江两省玉米北方炭疽病菌群体生物学特性分析

马晓宇 史学涛 唐广飞 夏信瑶 梅杰 宁娜 李智强 刘文德

摘要

由玉蜀黍球梗孢Kabatiella zeae引起的玉米北方炭疽病在我國东北地区普遍发生，在一些地区已成为玉米生产上的主要病害，严重影响玉米高产稳产，威胁我国粮食安全。为明确玉米北方炭疽病菌群体生物学特性，本研究于2020年7月－10月在吉林和黑龙江两省共17个地点采集了玉米北方炭疽病样品180份，并分离纯化到624个玉米北方炭疽病菌单孢菌株，通过形态学观测，科赫氏法则验证及分子生物学鉴定，确定所分离的病原菌均为Kabatiella zeae。依据菌落产黑色素能力与菌落生长情况将病原菌划分为4种不同菌落形态类型。本研究选择4株代表性菌株SH101（类型Ⅰ）、HB101（类型Ⅱ）、HN101（类型Ⅲ）和NA101（类型Ⅳ），对病原菌在两省分布比例、产孢能力、菌落生长速率，产孢方式和致病性等的比较结果显示，类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ在两省份病原菌群体总数中占98.8%;类型Ⅳ在两省份中只分离到7株，其生长速率较快。对类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ病原菌分析得出结论：产黑色素能力强的病原菌致病性较强且产孢能力较弱。研究结果可为玉米北方炭疽病的防治提供一定参考。

关键词

玉米北方炭疽病菌; 产孢能力; 菌落形态; 产孢方式; 致病性

中图分类号：

S 435.131.43

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022112

Biological characteristics of Kabatiella zeae population in Jilin and Heilongjiang provinces

MA Xiaoyu， SHI Xuetao， TANG Guangfei， XIA Xinyao， MEI Jie， NING Na， LI Zhiqiang*， LIU Wende*

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Eyespot of maize caused by Kabatiella zeae frequently occurred and has become the main disease of corn in northeast of China， which seriously affected the high and stable yield of corn and threatened the food security in China. To clarify the biological characteristics of K.zeae population， a total of 180 samples of K.zeae were collected from 17 sites in Jilin and Heilongjiang provinces from July to October 2020， and 624 strains of K.zeae were isolated and purified. The isolates were confirmed to be K.zeae by morphological observation， Kochs rule and molecular biological identification. The purified K.zeae colonies were divided into four different types： type Ⅰ， type Ⅱ， type Ⅲ and type Ⅳ， depending on the melaninproducing capacity and colonial morphology. In this study， four representative strains SH101 （type Ⅰ）， HB101 （type Ⅱ）， HN101 （type Ⅲ） and NA101 （type Ⅳ） were selected to compare their similarities and differences in terms of the distribution proportion of K.zeae in the two provinces， sporulation capacity， colony growth rate， sporulation mode and pathogenicity. The results showed that type Ⅰ， type Ⅱ and type Ⅲ accounted for 98.8% of the total number of pathogens in the two provinces. Only seven strains of type Ⅳ were isolated from the two provinces. They had a fast growth rate， and were separately classified into type Ⅳ. Through the analysis of type Ⅰ， type Ⅱ and type Ⅲ strains， it is concluded that K.zeae with strong melaninproducing ability had stronger pathogenicity and lower sporulation. These results provide a theoretical reference for the prevention and control of maize eyespot in northeastern China.

Key words

Kabatiella zeae; sporulation capacity; colony morphology; sporulation mode; pathogenicity

玉米北方炭疽病又名“玉米眼斑病”，由玉蜀黍球梗孢Kabatiella zeae Narita et Hiratsuka引起，主要分布在湿度较高、温度较低或海拔较高的玉米种植区［14］。1959年，Narita等首次报道日本发生玉米北方炭疽病，随后该病害在美洲、欧洲和亚洲等玉米种植区均有发生［5］。1963年玉米北方炭疽病在我国吉林省一些地区严重发生;1997年黑龙江、辽宁和云南等省报道发生玉米北方炭疽病，次年在辽宁省多个地点已普遍发生;2013年该病害在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北北部、陕西北部、云南和贵州的高海拔山区均有发生报道［610］。2020年7月－10月我们在采样过程中发现该病害在吉林和黑龙江两省发生严重。

玉米北方炭疽病主要侵染玉米叶片，初期产生极小的近圆形水渍状斑点，之后慢慢呈奶黄色或棕褐色，到后期中央部分坏死，病斑边缘呈紫色且伴有水渍状晕圈，直径1～4 mm，形状似鸟的眼睛，因此又称为“眼斑病”［2］。该病害在大田的发病症状与玉米弯孢叶斑病的发病症状相似，单从病斑表型上较难区分两种病害［8］，一般需要通过显微观测或分子检测其致病菌才能区分。玉米北方炭疽病发病严重时，病斑发生融合，叶片大面积脱水枯萎，从而导致植株早衰，严重影响光合作用造成减产［11］。据报道，自然状态下该病害发生时可造成9%的产量损失［12］。严重发生时能够引起感病自交系‘F522‘L2039和‘WF9等材料30%～50%的产量损失［11］。玉米北方炭疽病的发生还会加重根腐病、茎腐病和瘤黑粉病等其他病害的发生［13］。

玉米北方炭疽病菌在PDA培养基上生长良好，最适生长温度为25℃［14］。在PDA平板培养基上菌落革质、有褶皱，呈放射波纹状，生长速率缓慢。分生孢子梗短棒形，无色或淡褐色，顶端膨大，其上聚生分生孢子［15］，分生孢子呈无色弯月形，两端略尖，无隔，大小为（18.0～35.0）μm×（2.5～3.0）μm［16］。Chen等用9种玉米自交系对黑龙江、吉林、辽宁、云南等省103株菌株进行了毒力测试，其中品种‘Shen137和‘E28的抗病性最强，几乎对不同地域的病原菌都有较强的抗性［17］。

为了深入研究玉米北方炭疽病菌群体生物学特性与发生规律，本研究在吉林和黑龙江两省17个地点采集病斑样品;根据孢子形态特征和ITS序列信息，确定了624株玉米北方炭疽病菌菌株。依据菌落形态学特征进一步将这些菌株划分为4种类型：类型Ⅰ、类型Ⅱ、类型Ⅲ和类型Ⅳ。并对上述4种类型菌株的生长速率、产孢方式、产孢能力和致病性进行了测定。结合目前该病害的研究进展，明确其产孢方式及不同菌落形态菌株生物学特性，对了解该病害发生规律、综合防治具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌和植物：发病玉米叶片于2020年7月－10月采自吉林和黑龙江两省玉米主产区。室内接菌玉米品种为感病自交系‘B73，由本实验室保存。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，含氯霉素），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，含马铃薯浸粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂20.0 g/L;水琼脂培养基：15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

试剂与仪器：2×Rapid Taq Master Mix，北京诺唯赞公司;Trans2K Plus DNA Marker，全式金生物技术有限公司;PCR仪器，电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化

分离：据报道玉米北方炭疽病菌分生孢子多数存在于玉米叶片气孔下方叶肉组织中［16］，比较容易冲洗，故本研究采用洗脱涂板法对病原菌进行初步分离，采用挑针转移法［18］进一步分离纯化，即将病斑沿病健交界处切下，每片来自不同玉米植株的叶子选取一个病斑放入PCR管中，加入适量抗生素 （200 μg/mL氨苄青霉素），移液枪轻轻吹打，然后吸取适量洗脱液涂布在PDA培养基上，待孢子萌发挑单菌落;所挑单菌落菌株再次冲洗孢子并稀释，将菌液涂布于水琼脂平板上，显微镜下进行单孢分离纯化，纯化好的菌株于20%甘油中-80℃保存备用。

1.2.2 病原菌菌落形态划分

分离病原菌的过程中，发现吉林和黑龙江两省的菌株均有4种菌落形态类型，依据菌落产黑色素能力差异划分为类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ;类型Ⅳ的划分依据为其具有较快的生长速率，在本试验中分别选取菌株SH101、HB101、HN101、NA101为类型Ⅰ、类型Ⅱ、类型Ⅲ、类型Ⅳ的代表性菌株。

1.2.3 病原菌分子生物学鉴定

随机选取不同采样地点病原菌15株，PDA培养基上黑暗培养13 d。采用CTAB法提取玉米北方炭疽病菌基因组DNA，将其作为模板，利用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′），ITS4 （5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）进行PCR扩增。20 μL PCR 反应体系： 2×Rapid Taq Master Mix 10 μL，DNA模板 1 μL，上下游引物各 0.2 μL，DMSO 0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR扩增反应程序：95℃预变性5 min;95℃变性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，35次循环;72℃延伸10 min，4℃保存。獲得的 PCR产物送北京擎科生物科技有限公司测序，并将测序结果与NCBI中已有信息进行比对分析。

1.2.4 病原菌形态学鉴定

将经单孢分离纯化的菌株接种到PDA培养基上，25℃黑暗培养13 d，观察并描述菌落形态，从菌落边缘挑取菌丝制作切片，显微镜下观测菌丝特征及分生孢子形状、大小。

1.2.5 病原菌生长速率和产孢量统计

将菌株SH101（类型Ⅰ）、HB101（类型Ⅱ）、HN101（类型Ⅲ）、NA101（类型Ⅳ）在PDA上25℃黑暗培养15 d，在每种类型菌落相同的位置打3个直径8 mm的菌饼置于装有5 mL蒸馏水的50 mL离心管中，漩涡振荡器振荡10 min，血球计数板统计孢子数量，每组6次重复。游标卡尺测量菌落直径，每组3次重复。

1.2.6 病原菌致病性测定

对代表性菌株SH101、HB101、 HN101、NA101进行致病性测定，菌株在PDA培养基上25℃黑暗培养13 d。用0.05%无菌吐温水冲洗菌落，通过Miracloth过滤，利用血球计数板配制成6.25×106个/mL孢子悬浮液，23 cm×23 cm方形培养皿中铺设一层滤纸并加入50 mL蒸馏水保湿，同时加入100 μL 1 mg/mL 6BA起叶片保绿作用，剪取6叶期‘B73玉米的第一叶，放入方形皿中，每片叶滴2滴孢子悬浮液，每滴10 μL，25℃培养箱中黑暗培养24 h，然后在L∥D=12 h∥12 h条件下培养5 d观察发病情况。由于菌株NA101产孢量极低，对其采取了菌丝块接菌：在培养箱内先在25℃，相对湿度70%，黑暗条件下培养24 h，然后置于L∥D=12 h∥12 h条件下培养5 d，观察发病情况。拍照并进行病原菌再分离工作。

2 结果与分析

2.1 玉米北方炭疽病菌的采集分离

2020年7月-10月，从黑龙江省佳木斯市、齐齐哈尔市、绥化市绥棱县、哈尔滨市（黑龙江省农业科学院种植基地）、黑河市、鹤岗市萝北县、五大连池市;吉林省四平市梨树县、公主岭市、公主岭市怀德镇、公主岭市双龙镇、公主岭市黑林子镇、公主岭十二家子镇、长春市农安县、白城市镇赉县、通化市辉南县、松原市长岭县等17个地点采集玉米北方炭疽病的玉米病叶180份;共分离纯化到624株病原菌（表1，不同地点缩写为其首尾拼音字母），根据地域名称对所纯化病原菌进行编号，其中SH101来源于绥化市绥棱县，HB101来源于哈尔滨市的黑龙江省农业科学院基地，HN101来源于通化市辉南县，NA101来源于长春市农安县。

2.2 玉米北方炭疽病菌不同菌落形态划分

在病原菌分离的过程中，发现吉林省和黑龙江省菌株均出现了4种不同的菌落形态（图1a），类型Ⅰ（SH101）、类型Ⅱ（HB101）、类型Ⅲ（HN101）、类型Ⅳ（NA101）。其中类型Ⅰ菌落在生长过程中黑化时间较早，到后期完全黑化;类型Ⅱ黑化过程稍晚于类型Ⅰ，相同培养时间黑化程度弱于类型Ⅰ;类型Ⅲ生长初期为白色或浅粉色，生长后期只有菌落边缘周围黑化;类型Ⅳ菌落表面呈灰绿色，且表面有极短的粉末状菌丝。本文统计了4种菌落形态病原菌在两省的分布比例：其中黑龙江省类型Ⅰ菌落占比48.6%（142株），类型Ⅱ占比38.4%（112株），类型Ⅲ（37株）占比12.7%，类型Ⅳ只分离到1株（图1b）;吉林省类型Ⅰ占比38.6%（98株），类型Ⅱ占比32.5%（87株），类型Ⅲ占比28.7%（77株），类型Ⅳ占比2.2%（6株）（图1c）;由此可见，2020年大田主要以类型Ⅰ、类型Ⅱ为主，类型Ⅲ比例较类型Ⅰ和类型Ⅱ低，类型Ⅳ比例最低。

2.3 玉米北方炭疽病菌分子生物学鉴定

利用真菌鉴定通用引物ITS1和ITS4对选定的15个菌株基因组DNA进行PCR扩增，扩增片段长度均为557 bp （图2a）;将测序结果同本实验室采用PacBio和Illumina 方法全基因组组装的标准菌株KZ1结果进行比对，结果表明，15个菌株序列与标准菌株KZ1（序列ID： JAGFJS020000022.1）的相似性均为99.8%，15个测序结果均只有一个碱基发生突变，该碱基可能是一个进化上的SNP位点（图2b）。说明所分离的病原菌均为玉米北方炭疽病菌玉蜀黍球梗孢Kabatiella zeae。

2.4 玉米北方炭疽病菌形態学鉴定

玉米北方炭疽病菌在PDA培养基上生长缓慢，生长初期菌丝量极少但分生孢子量大。菌丝有隔，呈淡褐色或无色;分生孢子无隔，无色透明，大多数分生孢子两端尖，呈弯月形，少数孢子呈长梭形或近棒状。本研究中通过对分生孢子形态显微观察，确定所分离的病原菌均为玉蜀黍球梗孢。在对菌落切片显微观测时发现该病原菌存在3种分生孢子产生方式：顶生式（图3a）、侧生式（图3b， c， d）和再生（分生孢子上再生孢子）（图3f）。顶生式：菌丝顶端形成分生孢子梗，分生孢子梗上着生数个分生孢子。侧生式：菌丝两侧或者一侧产生分生孢子。再生（分生孢子上再生孢子）：在分生孢子的一端或者两端再生长出分生孢子。通过显微镜观测发现4种菌落形态类型的分生孢子和菌丝形态没有差异。

2.5 不同菌落类型生长速率和产孢能力差异

定量测定不同菌落类型菌株产孢能力和生长速率结果显示，类型Ⅰ、类型Ⅱ、类型Ⅲ产孢能力依次显著增加，类型Ⅳ产孢能力显著低于其他3种类型（图4a），显

微镜下观测类型Ⅳ菌落切片发现其菌丝量较其他3种类型多，分生孢子数量少;此外，类型Ⅳ菌株生长最快，显著高于其他3种类型菌株，类型Ⅱ菌株生长速率显著快于类型Ⅰ和类型Ⅲ（图4b）。

2.6 玉米北方炭疽病菌致病性测定

类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ菌株接种玉米叶片5 d后结果表明，类型Ⅰ菌株致病性最强，类型Ⅱ菌株次之，类型Ⅲ菌株处理没有发病（图5a，b，c）。由于类型Ⅳ菌株产孢量极低，难以获得接种量的孢子悬浮液，因此本研究采用菌丝块接种（图5d），结果表明，该类型菌株无致病能力。从类型Ⅰ（SH101）和类型Ⅱ（HB101）菌株所致病斑上再次进行病原菌分离，成功分离出玉米北方炭疽病菌，且与接种菌落形态一致，说明所分离菌株为玉米北方炭疽病菌。

3 结论与讨论

本研究根据玉米北方炭疽病症状特点、分生孢子形态特征、并结合ITS序列测序和致病性测定，证明所分离的玉米北方炭疽病的致病菌为玉蜀黍球梗孢 Kabatiella zeae。这与徐秀德等［8］和孙佳莹等［14］报道的玉米北方炭疽病致病菌相同。本研究前期使用常规的病原菌分离方法对从吉林和黑龙江两省共17个地点采集的玉米北方炭疽病样品进行分离，先用2%次氯酸钠和75%乙醇分别消毒20～30 s，无菌水冲洗3次后将病斑置于PDA培养基培养，但因玉米北方炭疽病菌生长速率缓慢，极易被其他杂菌覆盖，导致分离效率较低。早在1973年Dingley利用组织染色法观察玉米北方炭疽病菌侵染的叶片，发现病原菌存在于表皮细胞间、细胞内和气孔中［19］，2015年孙佳莹等同样发现分生孢子仅存在于病叶气孔中［14］;依据前人报道的玉米北方炭疽病菌分生孢子的分布特点，本研究采取洗脱涂板法进行了病原菌的分离，此分离方法有效避免了玉米北方炭疽病菌因生长较慢被其他杂菌覆盖的问题，提高了病原菌分离效率。

孙佳莹等报道玉米北方炭疽病菌分生孢子梗呈短棒形，无色或淡褐色，顶端膨大，其上聚生分生孢子［14］。病叶经保湿培养后可观察到分生孢子盘大多埋生于寄主气孔下，极小，淡褐色，无刚毛，这与前人报道一致［18］。本研究中通过制作切片，共聚焦显微镜观测到玉米北方炭疽病菌存在3种产孢方式：顶生、侧生和再生（分生孢子上再生孢子）。本研究未发现菌株产孢能力和产孢方式存在相关性，但该病原菌多种孢子产生方式可能是其在PDA上生长初期产生大量孢子的原因。

在分离病原菌时通过统计每种菌落类型菌株的分离比例，发现自然界中主要以类型Ⅰ和类型Ⅱ菌株为主，类型Ⅲ菌株较类型Ⅰ和Ⅱ少，类型Ⅳ菌株极少，仅在黑龙江齐齐哈尔地区分离到1株，长春农安县地区分离到6株;类型Ⅳ菌株产孢量极低，菌落生长速率明显快于其他3种类型，且菌落表面有极短的粉末状菌丝，其他3種类型菌落表面无粉末状菌丝;用菌丝块接种发现类型Ⅳ（NA101）菌株不致病，其不同于类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ生物学特性的原因有待进一步探索。类型Ⅰ、类型Ⅱ、类型Ⅲ菌落产孢量依次增加，菌落黑化程度依次减弱;类型Ⅲ黑化程度最弱且产孢量最高，因此我们推测孢子产量和菌落产黑色素能力存在负相关性，即产黑色素能力越强的菌株产孢量越低。现已有报道植物病原真菌合成黑色素的能力与其对寄主的侵染能力有正调控作用［20］。稻瘟病菌侵染水稻时可通过调节附着胞产生黑色素进而形成膨压和入侵栓以完成对宿主的侵染［21］。通过离体致病性测定试验，我们得到了类型Ⅰ、类型Ⅱ、类型Ⅲ致病性依次减弱的结论，这也与大田中致病性强的菌株类型（类型Ⅰ、类型Ⅱ）占比较高的统计结论相符合。本研究通过探究玉米北方炭疽病菌产孢量、致病性和产黑色素能力的关系，为探索其分子机理奠定了一定基础。

玉米北方炭疽病近几年在我国东北地区呈愈发严重的态势，本研究鉴定了吉林省和黑龙江省玉米北方炭疽病的致病菌，划分了不同的菌落类型，统计分析了不同类型病原菌的分布比例，明确了不同菌落形态间产孢量和致病性的关系及产孢方式等生物学特性，以上研究可为玉米北方炭疽病菌的研究和综合防治奠定坚实基础。

参考文献

［1］ 王晓鸣. 六种重要玉米病害病原名称的厘定［J］. 中国农业科学， 2018， 51（18）： 34973507.

［2］ ARNY D C， SMALLEY E B， ULLSTRUP A J， et al. Eyespot of maize， a disease new to North America ［J］. Phytopathology， 1971， 61（1）： 5457.

［3］ REIFSCHNEIDER F J B， ARNY D C. Seed infection of maize （Zea mays） by Kabatiella zeae ［J］. Plant Disease Reporter， 1979， 63（5）： 352354.

［4］ DOS SANTOS I， DA SILVA A， MALAGI G. Occurrence of maize eyespot caused by Kabatiella zeae in Paraná and Santa Catarina State ［J］. Brazil Fitopatologia Brasileira， 2007， 32（4）： 359.

［5］ NARITA T， HIRATSUKA Y. Studies on Kabatiella zeae n. sp. the causal fungus of a new leaf spot disease of corn ［J］. Japanese Journal of Phytopathology， 1959， 24（3）： 147153.

［6］ 戚佩坤， 白金铠， 朱桂香. 吉林省栽培植物真菌病害志［M］. 北京： 科学出版社， 1966： 2830.

［7］ 白金铠. 杂粮作物病害［M］. 北京： 中国农业出版社， 1997： 9698.

［8］ 徐秀德， 董怀玉， 姜钰， 等. 辽宁省玉米新病害——北方炭疽病研究初报［J］. 沈阳农业大学学报， 2000（5）： 507510.

［9］ 王晓鸣. 近年来我国玉米病害发生动态及未来发展趋势［C］∥第三届全国玉米病虫害防治关键技术专家论坛论文摘要集， 2013： 67.

［10］张崎峰. 浅谈玉米北方炭疽病［J］. 中国西部科技， 2014， 13（1）： 4950.

［11］SMILJAKOVIC H， PENCIC V. Kabatiella zeae Narita et Hiratsuka， agent of corn disease in Yugoslavia ［J］. Zastita Bilja， 1971， 22： 317321.

［12］REIFSCHNEIDER F J B， ARNY D C. Yield loss of maize caused by Kabatiella zeae ［J］. Phytopathology， 1983， 73： 607609.

［13］PENCIC V， ROZENWEFELD J. Contribution to the study of the resistance of maize to Kabatiella zeae Narita et Hiratsuka and symptoms of the disease ［J］. Arhiv za Poljoprivredne Nauke， 1979， 32（118）： 113120.

［14］孙佳莹， 肖淑芹， 路媛媛， 等. 辽宁省玉米北方炭疽病菌的分离鉴定及生物学特性［J］. 植物保护学报， 2015， 42（6）： 927934.

［15］GATES L F， MORTIMORE C G. Three diseases of corn （Zea mays） new to Ontario： crazy top， Phyllosticta leaf spot， and eyespot ［J］. Canadian Plant Disease Survey， 1970， 49（4）： 128131.

［16］薛春生， 孫佳莹， 陈楠， 等. 玉米北方炭疽病研究进展［J］.植物病理学报， 2020， 50（5）： 509516.

［17］CHEN Nan， XIAO Shuqin， SUN Jiaying， et al. Virulence and molecular diversity in the Kabatiella zeae population causing maize eyespot in China ［J］. Plant Disease， 2020， 104（12）： 31973206.

［18］龚国淑， 徐琴， 张敏， 等. 一种简便的病原真菌单孢分离方法研究［J］. 玉米科学， 2010， 18（1）： 126127.

［19］DINGLEY J M. ‘Eye spot disease of maize in New Zealand ［J］. New Zealand Journal of Agricultural， 1973， 16（3）： 325328.

［20］樊荣， 王春生， 赵蕊， 等. 植物病原真菌1，8间苯二酚黑色素研究进展［J］.微生物学通报， 2020， 47（11）： 36713677.

［21］RYDER L S， DAGDAS Y F， KERSHAW M J， et al. A sensor kinase controls turgordriven plant infection by the rice blast funs ［J］. Nature， 2019， 574（7778）： 423427.

（责任编辑：杨明丽）