猕猴桃种传潜隐病毒外壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

杨馥韩 余兆耀 尹世欣 龙友华 王勇 陈相儒

摘要

獼猴桃种传潜隐病毒 （actinidia seed borne latent virus， ASbLV），属于乙型线状病毒科Betaflexiviridae李属病毒属Prunevirus，是一种在我国猕猴桃上广泛发生的病毒。本研究通过RTPCR方法克隆ASbLV的外壳蛋白基因，并连接到原核表达载体 pET28a（+）上，转化大肠杆菌Rosetta （DE3），经IPTG诱导后可表达分子量约为28 kD的融合蛋白。经过 Ni2+NTA树脂纯化融合蛋白，然后以其为抗原制备多克隆抗体。Western blot结果表明，多克隆抗体的效价为1∶4 000。该多克隆抗体只与ASbLV发生特异性反应，而不与猕猴桃病毒1、猕猴桃病毒A、苹果茎沟病毒、柑橘叶斑驳病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒发生反应，说明该多克隆抗体特异性良好。利用间接ELISA对36份猕猴桃田间样品进行了ASbLV检测，检测结果表明其中20份样品被ASbLV侵染，且间接ELISA检测结果与RTPCR检测结果一致。本研究建立的间接ELISA方法能够有效地应用于猕猴桃田间样品中的ASbLV检测。

关键词

猕猴桃种传潜隐病毒; 外壳蛋白; 原核表达; 多克隆抗体

中图分类号：

S 436.634.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022135

Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of the coat protein of actinidia seedborne latent virus

YANG Fuhan， YU Zhaoyao， YIN Shixin， LONG Youhua， WANG Yong， CHEN Xiangru*

（College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract

Actinidia seedborne latent virus （ASbLV）， which belongs to the genus Prunevirus in the family Betaflexiviridae， is a common virus on kiwifruit in China. In this study， the coat protein （CP） gene of ASbLV was amplified from ASbLVinfected leaves of kiwifruit by RTPCR， fused to the prokaryotic vector pET28a（+） and transformed into Escherichia coli Rosetta （DE3）. After induced with IPTG， the fusion protein with a molecular weight of 28 kD was expressed. The fusion protein purified by Ni2+NTA resin was used for preparation of polyclonal antibody. Western blot result showed that the polyclonal antibody titer was 1∶4 000. This polyclonal antibody reacted specifically with ASbLV， but did not react with the other six viruses infecting kiwifruit， including actinidia virus 1， actinidia virus A， apple stem grooving virus， citrus leaf blotch virus， cucumber mosaic virus and potato virus X. Indirect ELISA （IDELISA） result showed that 20 of the 36 samples were positive. The IDELISA result was consistent with those of RTPCR. In this study， we successfully established an IDELISA method based on the specific antibody of ASbLV. This method can be efficiently applied to detecting ASbLV from field samples.

Key words

actinidia seed borne latent virus （ASbLV）; coat protein （CP）; prokaryotic expression; polyclonal antibody

中华猕猴桃Actinidia chinensis属猕猴桃科Actinidiaceae猕猴桃属Actinidia，原产于中国，已有130多年的栽培历史［1］。猕猴桃营养丰富，具有很高的食用价值和经济价值，深受人们喜爱［2］。据统计，目前能够侵染猕猴桃的病毒共有24种［36］，我国猕猴桃上发现并报道的猕猴桃病毒共有17种［37］，其中猕猴桃病毒 A （actinidia virus A， AcVA）、猕猴桃病毒 1 （actinidia virus 1， AcV1）、柑橘叶斑驳病毒 （citrus leaf blotch virus， CLBV）、猕猴桃褪绿环斑相关病毒（actinidia chlorotic ringspotassociated virus， AcCRaV） 和猕猴桃种传潜隐病毒（actinidia seed borne latent virus，ASbLV）发生率较高。

猕猴桃种传潜隐病毒由Veerakone等［8］于2018年在新西兰的中华猕猴桃上首次发现并报道。ASbLV能够通过种子自然传播，也能够通过机械传播，广泛分布于全球各猕猴桃种植主产区，新西兰［8］、韩国以及中国陕西［45］、贵州、江西［9］、重庆［9］、湖北［9］均有发生。ASbLV侵染猕猴桃后叶片症状表现为叶脉褪绿和斑驳。

ASbLV属乙型线状病毒科Betaflexiviridae李属病毒属Prunevirus。该病毒基因组由一条长8 192 nt的正义单链 RNA 组成，共编码4个开放阅读框，分别编码1个与复制相关的蛋白、1个运动蛋白、1个外壳蛋白（coat protein， CP）及1个核酸结合蛋白。

本文通过RTPCR克隆ASbLV CP基因，构建其原核表达载体，获得原核表达蛋白，制备ASbLV CP多克隆抗体，利用多克隆抗体建立了ASbLV的间接ELISA检测方法，为该病毒的田间检测提供技术支持，为进一步深入研究ASbLV CP的功能及ASbLV的致病机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

感染了ASbLV、AcVA、AcV1、CLBV、苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯 X 病毒（potato virus X，PVX）的猕猴桃叶片采自贵州省息烽县和贵州省六盘水市。快速通用植物RNA提取试剂盒购自华越洋（北京）公司，大肠杆菌DH5α、Rosetta （DE3）购自通用生物（安徽）公司，限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ购自宝日医生物技术（北京）有限公司。pUC19T克隆载体购自擎科生物公司，pGD系列载体由中国农业大学韩成贵教授惠赠，pET28a（+）原核表达载体由中国农业大学刘俊峰教授惠赠。

1.2 ASbLV CP 基因克隆及原核表达载体的构建

根据GenBank中登录的ASbLV （NC_040800.1）基因序列，用Primer Premier 5.0设计引物，PCPF： 5′GGATCCATGTCAGCGAAGTTGGCAAAGA

AGAGG3′ （下划线为BamHⅠ酶切位点），PCPR：

5′CTCGAGCACTATTAGATTAACTGCTGAC

TCC3′ （下划线为XhoⅠ酶切位点），通过RTPCR扩增ASbLV CP基因。PCR反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环;72℃延伸10 min。用1.2% 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，产物经纯化后，连接到 pUC19T载体并转化大肠杆菌 DH5α，筛选出的阳性克隆送擎科生物（重庆）公司测序。重组质粒 pUC19TASbLVCP 测序验证无误后用BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切，并将回收的目的条带连接到经同样双酶切的pET28a（+）载体上，转化大肠杆菌DH5α提取质粒，经双酶切鉴定成功构建原核表达载体pET28aASbLVCP。

1.3 ASbLV CP 蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

将pET28aASbLVCP和pET28a（+）质粒分别转化大肠杆菌 Rosetta（DE3）感受态细胞。培养过夜的菌液按1∶100比例接种于LB （含50 μg/mL Kan）液體培养基中，37℃ 220 r/min培养至OD600为0.5～0.8时加入终浓度为1 mmol/L IPTG，置于不同温度（16、25、30、37℃）诱导培养6～8 h。12 000 r/min离心1 min收集菌体，加入200 μL PBS 缓冲液重悬菌体，冰上超声破碎细胞，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清转移至新的离心管中，加入SDS上样缓冲液，100℃ 变性 10 min，立即置于冰上5 min，取10 μL变性后的蛋白样品进行SDSPAGE分析，判断ASbLV CP蛋白最佳表达温度。

根据SDSPAGE分析结果选择37℃进行ASbLV CP蛋白大量诱导表达，培养过夜的菌液按1∶100比例接种于500 mL LB （含50 μg/mL Kan）液体培养基中，37℃ 220 r/min培养2～4 h，OD600达到0.5～0.8 时加入终浓度为1 mmol/L IPTG，37℃ 220 r/min诱导培养6 h。12 000 r/min离心1 min收集菌体，加入30 mL PBS缓冲液（含8 mol/L脲）重悬菌体，冰上超声破碎细胞，使用Ni2+NTA Agarose亲和层析柱纯化融合蛋白，用含有不同浓度咪唑（10、50、100、200、400 mmol/L）的PBS缓冲液进行洗脱［10］，用SDSPAGE对不同咪唑浓度的洗脱液进行检测，根据检测结果选择相应的洗脱液进行蛋白的脱盐和浓缩。将纯化好的目的蛋白送至艾比玛特生物医药（上海）公司制备多克隆抗体。

1.4 多克隆抗体效价检测

将ASbLV CP多克隆抗体分别稀释1 000、2 000、4 000、8 000、16 000倍作为一抗反应液，利用Western blot检测多克隆抗体的效价。用携带pGDCPASbLV3flag植物瞬时表达载体的农杆菌浸润接种本氏烟Nicotiana benthamiana，3 d后取0.1 g接种叶于液氮中研磨，参照刘玉姿等［11］的方法提取本氏烟叶片总蛋白，以接种含pGDGFP载体的农杆菌的本氏烟叶片总蛋白作为阴性对照。

1.5 抗血清特异性检测

采用间接酶联检测法（indirect enzymelinked immunosorbent assay， IDELISA）检测多克隆抗体的特异性。提取感染AcV1、AcVA、ASbLV、ASGV、CLBV、CMV、PVX的猕猴桃叶片蛋白以及健康猕猴桃叶片蛋白，按1∶20的比例将蛋白与包被缓冲液（0.05 mmol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6）进行稀释，每孔中加100 μL样品混合液 （每个样品2个重复），37℃孵育2 h;每孔加350 μL PBST洗涤4次后，每孔加200 μL 5%脱脂奶粉溶液，37℃封闭2 h;每孔加350 μL PBST洗涤4次后，加ASbLV CP多克隆抗体反应液（ASbLV CP多克隆抗体∶PBST=1∶1 000），37℃孵育2 h;每孔加350 μL PBST 洗涤4次，加HRP标记的羊抗兔二抗反应液（二抗∶PBST=1∶10 000）

，37℃孵育1 h;每孔加350 μL PBST洗涤4次，加TMB显色液100 μL，室温避光显色15～20 min，显蓝色，若颜色偏浅，可放在37℃ 显色，显色时间不超过30 min;每孔加终止溶液100 μL，此时蓝色变为黄色;加入终止液后5 min内进行读数，以630 nm为校正波长，用酶标仪测量各孔在450 nm的OD值，并用OD450进行分析。

1.6 ASbLV CP多克隆抗体的田间应用

利用所制备的ASbLV CP多克隆抗体，通过间接ELISA法对采自贵阳市修文县、息烽县和六盘水市猕猴桃果园的36份猕猴桃叶片样品进行ASbLV检测，其中表现为黄化的叶片样品12份，皱缩的叶片样品5份，叶斑驳的叶片样品7份，无明显症状的样品12份，并利用RTPCR方法进行验证。猕猴桃叶片的总蛋白使用Sigma公司的Plant Total Protein Extraction Kit进行提取。

2 结果与分析

2.1 ASbLV CP基因克隆及原核表达载体的构建

通过RTPCR从感染 ASbLV的猕猴桃叶片总RNA中扩增得到ASbLV CP基因，长度为 666 bp（图1a）。将PCR产物纯化后连接pUC19T载体，测序验证无误后，使用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切重组质粒pUC19TASbLVCP和pET28a（+）空载体，回收相应条带并连接，转化大肠杆菌DH5α，提取阳性克隆质粒。双酶切鉴定重组质粒pET28aASbLVCP，結果得到与预期大小相符的插入片段，说明pET28aASbLVCP重组质粒构建成功（图1b）。

2.2 ASbLV CP蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDSPAGE 结果表明，与含pET28a（+）空载体的菌株相比，含重组质粒pET28aASbLVCP的菌株可表达大小约28 kD的融合蛋白，与预期结果一致。此外，在16、25、30、37℃条件下，绝大多数ASbLV CP蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，上清中ASbLV CP蛋白表达量较少（图2a）。利用6×HisTag抗体为一抗进行Western blot检测，结果表明含pET28aASbLVCP重组质粒的大肠杆菌总蛋白在分子量约28 kD处有一条特异条带，而与含pET28a（+）空载体的大肠杆菌总蛋白无特异性反应，说明融合蛋白表达成功（图2b）。

对用含有不同浓度咪唑的PBS 缓冲液洗脱的重组蛋白进行SDSPAGE检测，结果表明含浓度为200 mmol/L咪唑的PBS缓冲液洗脱目的蛋白效果较好，因此选择其进行蛋白的脱盐和浓缩。将纯化好的蛋白免疫新西兰大白兔以获得多克隆抗体。

2.3 ASbLV CP多克隆抗体效价评价

将多克隆抗体稀释到不同浓度进行Western blot 检测，结果表明1∶1 000、1∶2 000和 1∶4 000都能够检测到特异性条带，1∶8 000和1∶16 000则检测不到，因此ASbLV CP 多克隆抗体效价为1∶4 000（图3）。

2.4 ASbLV CP多克隆抗体特异性检测

将多克隆抗体以1∶1 000倍稀释，利用间接ELISA方法检测多克隆抗体特异性，结果表明（表1），

感染ASbLV样品的OD450为0.773，健康样品的OD450为0.099，OD450是健康样品OD450的2倍以上，具有良好的阳性反应，而被AcV1、AcVA、ASGV、CLBV、CMV、PVX侵染的猕猴桃叶片的OD450与健康样品OD450的比值均小于2，说明制备的ASbLV CP多克隆抗体只对ASbLV有血清学反应，与被AcV1、AcVA、ASGV、CLBV、CMV、PVX侵染的猕猴桃叶片无特异性反应，因此ASbLV CP多克隆抗体的特异性较好，可应用于田间猕猴桃样品中的ASbLV检测。

2.5 ASbLV CP多克隆抗体的田间应用

使用间接ELISA法对36份猕猴桃田间样品进行检测，间接ELISA检测结果（图4a）显示20份样品被ASbLV侵染，阳性率为55.6%。经RTPCR （图4b）方法验证，间接ELISA与RTPCR检测结果一致率为100%，说明本研究制备的ASbLV CP多克隆抗体能够应用于田间样品的检测。

3 结论与讨论

目前植物病毒的检测技术主要有生物学检测法［12］、血清学检测法［1314］、电子显微镜技术［15］、RTPCR等。血清学检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高和特异性强等优点，被广泛应用于植物病毒的检测，是一种重要的病毒检测技术［16］。快速、准确、灵敏的检测手段对于病毒的检测和防控至关重要。

本研究克隆了ASbLV贵州分离物的CP基因，构建了pET28aASbLVCP的原核表达载体，pET28aASbLVCP重组质粒转化大肠杆菌Rosetta （DE3）后，经IPTG诱导表达、纯化、透析、脱盐等步骤获得纯化的ASbLV CP蛋白，并以此为抗原制备了ASbLV CP的多克隆抗体，使用Western blot进行了多克隆抗体的效价检测，使用间接ELISA方法檢测多克隆抗体特异性，结果表明该抗体的效价为1∶4 000且特异性良好。鉴于ASbLV在我国各猕猴桃种植区广泛发生，严重制约我国猕猴桃产业的可持续发展，因此有必要对该病毒的发生情况进行监测和预警。目前，ASbLV的检测方法主要是RTPCR，未见血清学检测的相关报道，因此建立快速可靠的血清学检测技术对ASbLV的检测和防治十分重要。本研究通过制备ASbLV外壳蛋白的多克隆抗体，建立了ASbLV的间接EILSA检测方法，该方法能够有效应用于大批量田间样品的ASbLV检测，为今后开展该病毒的检测和致病分子机理研究奠定基础。

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（责任编辑：田 喆）