薄壳山核桃疮痂病菌Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立及应用

赵玉强 卓可儿 郭云 朱灿灿 王行军 陆小美 田艳丽 胡白石

摘要

瘡痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害，带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异，设计了特异性引物和TaqMan探针，建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明，该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株，而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时，检测时间仅需1 h，远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。

关键词

薄壳山核桃疮痂病菌; 荧光定量PCR; TaqMan探针; 快速检测

中图分类号：

S 436.64

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022163

Development and application of TaqMan fluorescence quantitative PCR for detection of Venturia effusa

ZHAO Yuqiang1*， ZHUO Keer2， GUO Yun2， ZHU Cancan1， WANG Xingjun3， LU Xiaomei4，TIAN Yanli2， HU Baishi2

（1. Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences （Nanjing Botanical Garden Mem.

Sun YatSen）， Nanjing 210014， China; 2. College of Plant Protection，Nanjing Agricultural University， Key

Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests， Ministry of Education， Nanjing 210095，

China; 3. Anhui Fengyang Plant Protection Station， Chuzhou 233100， China; 4. Changzhou Guomei

Agricultural Technology Co.， Ltd.， Changzhou 213245， China）

Abstract

Venturia effusa causes pecan scab， which is the most destructive disease in pecan orchards. The funguscarrying plant materials are the important sources for transmission of the scab disease. Accurate， sensitive and rapid detection of the pathogenic fungi provides powerful measures for investigation of epidemical regularity and control of this disease. In this study， a pair of primers and a TaqMan probe based on the internal transcribed spacers （ITSs） of V.effusa and its related species were designed and synthesized for fluorescence quantitative PCR assay. The results showed that the fluorescence quantitative PCR assay facilitated detection of all V.effusa strains regardless of their geographical origins， while no signals were detected for the other fungi tested， including the closely related Venturia species and other fungi isolated from pecans. The detection limit of this assay was 0.5 pg/μL of total DNA. Compared to conventional culture method， the fluorescence quantitative PCR assay was rapid and reliable for detection of V.effusa in the field; the whole detection process can be finished in one hour， which provides a valuable tool for rapid detection and identification of V.effusa.

Key words

Venturia effusa; fluorescence quantitative PCR; TaqMan probe; rapid detection

薄壳山核桃Carya illinoinensis （Wangenh.） K. Koch又称美国山核桃，是绿化的优选树种，其果实又称碧根果，是世界著名的干果之一。薄壳山核桃原产于美国和墨西哥北部，因其较高的经济价值目前已被引种到全球20多个国家和地区［12］。大量研究表明，疮痂病（scab）是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害［35］。该病害起源于美国，目前已广泛分布于全球各大薄壳山核桃种植区，包括美国、墨西哥、南美洲、南非以及中国［3，6］。我国引进薄壳山核桃已有100多年的历史，在国内先后建立了多处万亩薄壳山核桃基地，发展势头强劲［68］。然而，随着种植面积的不断扩大，病虫害发生日益严重，尤其是疮痂病的发生严重影响了果实的产量和质量。

薄壳山核桃疮痂病的病原为散生黑星菌Venturia effusa，可侵染薄壳山核桃的叶片、果实和嫩枝，导致植物的光合作用面积减少，进而影响果实的大小和质量［35］。目前，薄壳山核桃疮痂病菌的检测主要以传统的分离培养法为主［9］。然而，薄壳山核桃疮痂病菌在人工培养条件下生长缓慢，容易受到其他腐生菌的干扰而使分离培养具有一定难度，同时检测效率很低。尚未见关于薄壳山核桃疮痂病菌分子生物学检测的报道。

本研究基于TaqMan探针的荧光定量PCR方法建立了薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测方法，构建了标准曲线，并对方法的特异性和灵敏度进行了验证，同时评价了该方法对实际样品的检测效果。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株包括分离自江苏句容、高淳、金坛、泗洪和东海地区薄壳山核桃种植园的疮痂病菌15株，以及薄壳山核桃疮痂病菌的形态近似种和薄壳山核桃上分离的其他真菌共计21株。本研究的参试菌株分别来源于江苏省中国科学院植物研究所和南京农业大学植物检疫实验室（表1）。

1.2 仪器和试剂

荧光定量PCR仪为ABI公司生产的7500型。真菌DNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司生产。Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、pMD19T载体连接试剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。

1.3 核酸提取

按照真菌 DNA 提取试剂盒说明书提取待测菌株的基因组DNA。

1.4 引物及探针的设计与合成

分离自江苏金坛的薄壳山核桃疮痂病菌JT11菌株的ITS序列，为本研究测序后上传至GenBank （登录号：ON055759），该序列与NCBI中薄殼山核桃疮痂病菌多个菌株的一致性均超过99%。利用BioEdit软件进行序列比对，寻找差异位点设计薄壳山核桃疮痂病菌的特异性引物对VEF/VER（5′TAGTCTGAGAACCAGTCG3′/5′CGGGGACGGGGCTCAACG3′）和探针VEP（5′FAMCACACCTGTTCGAGCGCCATTTCABHQ13′），预期产物大小为224 bp（图1）。探针和引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 荧光定量PCR反应体系的优化与建立

以分离自江苏金坛的薄壳山核桃疮痂病菌JT11菌株的DNA（50 pg/μL）作为荧光定量PCR扩增模板。20 μL反应体系为： Premix Ex Taq（TaKaRa）10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，TaqMan探针0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。反应条件为： 95℃ 30 s;95℃ 15 s，60℃ 35 s，40个循环。试验重复3次。

荧光定量PCR反应体系的优化主要是对反应体系中的引物和探针浓度进行优化。上、下游引物浓度设置为0.1～1 μmol/L，并以0.1 μmol/L依次递增;探针浓度设置为0.2～1 μmol/L，以0.2 μmol/L依次递增，其他条件不变。反应结束后根据Ct值和ΔRn值确定最佳引物和探针浓度。

1.6 标准曲线的建立

1.6.1 标准质粒的构建

以提取的JT11菌株基因组DNA为模板，利用引物VEF/VER进行PCR扩增。回收目的片段后与pMD19T载体连接、转化DH5α感受态细胞。挑选阳性克隆子37℃过夜摇菌后，提取质粒，并委托南京擎科生物公司进行测序验证。经鉴定正确后，利用分光光度计测定质粒浓度，并按照下列公式计算质粒拷贝数：

标准质粒的拷贝数=（质量数×6.023×1023）/（质粒碱基对数×660）。

1.6.2 标准曲线的制作

将标准质粒进行10倍倍比稀释，得到3×107～3×101 拷贝/μL 系列模板，利用优化后的检测体系进行荧光定量PCR，将得到的Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数为横坐标，制作标准曲线。

1.7 特异性检测

采用真菌 DNA 提取试剂盒提取表1中菌株基因组DNA，浓度调整为50 pg/μL作为检测模板。以菌株JT11的基因组DNA为阳性对照，无菌超纯水为阴性对照，利用优化的最佳反应体系和条件进行特异性检测。

1.8 灵敏度检测

以JT11菌株的基因组DNA为模板，利用无菌水对模板进行梯度稀释，得到5×102～5×10-2 pg/μL系列浓度，进行荧光定量PCR检测。

1.9 实际样品检测

采自南京高淳、安徽凤阳、浙江临安地区的病叶和病果样品共计18份。植物样品按照Wang 等的NaOH法［10］提取DNA。主要方法为：取发病的植物组织，每毫克组织中加入10 μL NaOH（0.5 mol/L）， 在1.5 mL离心管中充分研磨后，12 000 r/min离心5 min，取5 μL上清液，加入495 μL Tris緩冲液（100 mmol/L，pH 8.0），充分混合后取1 μL用于荧光定量PCR检测。同时，对样品进行病原菌分离，并对其进行ITS序列分析，与本研究建立的荧光定量PCR方法的检测结果进行比对。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR反应体系的优化与建立

通过比较不同浓度的引物和探针反应后的Ct值和ΔRn值，并在扩增效率差异不明显的情况下，从经济节约的角度考虑，引物浓度为0.5 μmol/L、探针的浓度为0.6 μmol/L时为最佳反应浓度。本研究最终建立的反应体系（20 μL）为： Premix Ex Taq 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上、下游引物VEF/VER（终浓度为0.5 μmol/L）各 0.4 μL，TaqMan探针VEP（终浓度为0.6 μmol/L）0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。

2.2 标准曲线的建立

以10倍倍比稀释的3×107～3×101 拷贝/μL的重组质粒为模板，以空质粒为阴性对照，进行荧光定量PCR扩增。结果如图2所示，模板浓度与可检测到的荧光信号的循环数呈负相关，相关系数R2=0.997 7，大于0.98， 表明Ct值与倍比稀释的标准质粒浓度之间具有良好的线性关系。

2.3 特异性检测结果

利用2.1中优化建立的检测体系，对15株薄壳山核桃疮痂病菌以及21株参试菌株进行荧光定量PCR检测。检测结果如图3所示，不同来源的15株薄壳山核桃疮痂病菌均有明显的扩增曲线，Ct值为24.21～25.66，而其他参试菌株以及阴性对照均无扩增（本试验中Ct值>35视为阴性）。结果表明，本研究设计的引物和探针具有较好的种内适用性和种间特异性。

2.4 灵敏度检测

将JT11菌株的DNA模板浓度稀释为500、50、5、0.5 pg/μL和0.05 pg/μL，分别进行荧光定量PCR检测。灵敏度试验结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR检测的最低DNA浓度为0.5 pg/μL（图4），即20个分生孢子的基因组DNA。

2.5 实际样品检测结果

利用分离培养和荧光定量PCR法对采自南京高淳、安徽凤阳、浙江临安地区的18份病叶和病果样品进行了检测。结果显示，荧光定量PCR检测中有10份样品呈阳性，结果与分离培养法一致。但是，薄壳山核桃疮痂病菌人工培养生长缓慢，分离培养法所需试验周期长，分离和鉴定过程需要1个月左右，且容易受到腐生菌的干扰，需要多次分离。综上所述，荧光定量PCR法检测薄壳山核桃疮痂病菌特异性强且省时省力，适用于实际样品的快速检测。

3 结论与讨论

薄壳山核桃疮痂病是世界各薄壳山核桃产区的重要病害［3，6］，在其传播过程中，薄壳山核桃疮痂病菌随带病苗木和接穗的调运进行远距离传播，进而造成病区的扩大和形成新病区［11］。因此，为避免薄壳山核桃产业因疮痂病带来的损失，亟须准确、快速的检测技术，限制带菌苗木的传播，保障薄壳山核桃产业的健康发展。本研究以ITS序列为靶标，建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。结果表明，结合DNA快速提取法，本研究建立的检测体系对实际样品检测仅需1 h，实现了病害的快速检测。

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害［45］。目前，关于疮痂病病原的鉴定，主要采用分离培养法。然而，由于薄壳山核桃疮痂病菌人工培养生长缓慢，给分离培养带来一定难度，同时效率很低。本文建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法，能够特异性识别薄壳山核桃疮痂病菌，检测的最低限DNA为0.5 pg/μL，且检测时间仅需1 h，在检测效率上远高于常规的分离培养法。

薄壳山核桃疮痂病菌属于黑星菌属真菌，与枝孢属 Cladosporium sp.的分生孢子在形态上相似，早期被鉴定为枝孢菌［1213］。直至2005年，Beck等［14］根据ITS序列，才将薄壳山核桃疮痂病菌重新划分为V.effusa。前期研究发现，在蚜虫发生严重的种植园，枝孢霉能够引起薄壳山核桃的煤污病［15］。因此，我们在设计薄壳山核桃疮痂病菌特异性引物时，将分离自薄壳山核桃的枝孢霉作为近似种进行序列比对，并进行特异性检测。此外，我们在评价薄壳山核桃疮痂病菌荧光定量PCR检测体系的特异性时，还使用了薄壳山核桃褐斑病菌Colletotrichum sp.、黑斑病菌Pestalotiopsis microspora以及枝枯病菌 Diaporthe sp.作为测试菌株。结果发现，本研究建立的薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法对来自薄壳山核桃的不同病原菌有区分能力，说明该方法的检测结果准确可靠。

综上所述，TaqMan荧光定量PCR技术具有特异性好、灵敏度高和耗时短等

［10］WANG Hong， QI Meiqing， CUTLER A J. A simple method of preparing plant samples for PCR ［J］. Nucleic Acids Research， 1993， 21（17）：41534154.

［11］BOCK C H， COTTRELL T E， HOTCHKISS M W， et al. Vertical distribution of scab in large pecan trees ［J］. Plant Disease， 2013， 97（5）： 626634.

［12］PARTRIDGE E C， MORGANJONES G. Notes on Hyphomycetes. XC. Fusicladosporium， a new genus for Cladosporiumlike anamorphs of Venturia， and the pecan scabinducing fungus ［J］. Mycotaxon， 2003， 85（8）： 357370.

［13］SCHUBERT K， BRAUN U. Fusicladium effusum. ［Descriptions of fungi and bacteria］ ［M］∥IMI descriptions of fungi and bacteria. Wallingford， UK： CAB International， 2002： 1514.

［14］BECK A， RITSCHEL A， SCHUBERT K， et al. Phylogenetic relationships of the anamorphic genus Fusicladium s. lat. as inferred by ITS nrDNA data ［J］. Mycological Progress， 2005， 4（2）： 111116.

［15］陈雅琦， 莫正海， 娄文睿， 等. 薄壳山核桃煤污病病害调查及病原菌鉴定［J］. 经济林研究， 2021， 39（4）： 195202.

（責任编辑：田 喆）