北京地区桃黑斑病新症状的发现与诊断

周莹 周悦妍 李永华 李世访 燕继晔

摘要

2019年-2020年在北京地区桃园病害调研普查时发现一种桃树病害的新发症状新叶坏死，主要症状表现为当年新生枝条顶端新叶和生长点腐烂坏死。为明确这种新叶坏死症状是否由病原菌侵染引起，从北京平谷2个乡镇3个桃园采集35份病梢样品，经病样组织分离和菌株纯化，选取12个代表性菌株进行形态学鉴定、系統进化分析以及致病性测定。结果显示，通过形态学鉴定和多基因（ITS， Alt a1， gpd）系统发育分析，以上分离株均鉴定为链格孢Alternaria alternata;3株代表性菌株的致病性测定验证了A.alternata是引起新叶坏死症状的病原菌，并且该病原菌也能导致桃枝条和果实发病，产生黑斑病症状。这是首次报道A.alternata除了引起桃果实黑斑症状之外，还可以引起桃树新叶坏死症状，结果进一步丰富了链格孢侵染桃树的症状多样性，为链格孢引起的病害的整体防控提供了理论基础。

关键词

桃树; 新叶坏死; 新症状; 病原鉴定; 链格孢

中图分类号：

S 436.621.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021551

Occurrence and diagnosis of new symptoms of peach black spot disease in Beijing

ZHOU Ying1，2， ZHOU Yueyan1， LI Yonghua1， LI Shifang2， YAN Jiye1*

（1. Institute of Plant Protection， Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Beijing Key Laboratory of Environment

Friendly Management of Fruits Pests in North China， Beijing 100097， China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant

Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

A new young leaf necrosis symptom was observed in peach orchards located in Beijing during 2019-2020： brown rot spots on growing tips and new leaves of young shoots. To determine whether the symptom is caused by pathogenic infection， 35 samples were collected from three peach orchards in two towns of Pinggu， Beijing. After pathogen isolation， twelve representative fungal isolates were identified as Alternaria alternata according to morphological characteristics and multigene （ITS， Alt a1， gpd） phylogenetic analysis. Pathogenicity assay of three representative isolates confirmed that A.alternata was the causal agent of young leaf necrosis symptom. It also caused black spot symptom on twigs and fruits. Our study provides new evidences for the symptoms caused by A.alternate and a new theoretical basis for integrated control of this disease.

Key words

peach; young leaf necrosis; new symptom; identification; Alternaria alternata

桃树Prunus persica L.原产于我国，至今有4 000多年的栽培历史。桃树在我国南北方广泛种植，2020年我国桃树种植面积达到了86.70万hm2［1］，产量位居世界第一，是我国仅次于苹果、梨的第三大落叶果树［2］。桃树生长过程中，会受到很多病害的影响，包括褐腐病、黑斑病、穿孔病、流胶病等［3］。随着桃园种植年限增加、品种更替以及气候环境的改变等多因素影响，近年来一些桃园出现了一些新的病害问题［45］。2019年－2020年期间在北京地区桃园病害调研普查时发现一种新的症状，该症状发生在当年新生枝条顶端，初期在生长点及嫩梢新叶形成腐烂坏死，随着病害的发展，坏死向周围叶片扩展，造成新梢顶端萎蔫干枯，影响次年结果枝的生长发育，造成产量损失;该症状与梨小食心虫引起的折梢症状很相似，有时会被误判为虫害现象。为了明确这种症状是否由病原菌侵染引起，本研究收集田间病样进行病原菌分离、鉴定以及致病性试验，从而为该病害防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害症状观察

2019年-2020年连续2年在北京平谷峪口镇和大华山镇桃树种植园选3个果园对桃树新叶坏死症状的发生情况进行调查，品种主要有‘秋彤‘早蜜‘瑞光28号，从5月起每隔10～14 d观察一次，记录症状的形成与发展过程，7月调查记录病梢率，每个果园随机选取5株树，每株树在东西南北4个方位各调查10个当年新发枝条。

病样采集及接种材料：从北京平谷3个病害调查点采集具有典型新叶坏死症状的桃树新梢病样共计35个;离体接种材料为‘瑞光5号的叶片和‘北京14号枝条、果实，活体接种材料为温室种植的‘瑞光5号桃树植株。

1.2 病原菌的分离纯化

采集田间桃树发病新梢，在新叶病健交界处剪取5 mm×5 mm的小块组织，用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水清洗3次，在灭菌滤纸上晾干后放置于PDA平板上，25℃恒温培养箱中培养3～5 d，待菌落长出后挑取菌落边缘菌丝纯化后进行单孢分离。

1.3 病原菌的形态学观察

纯化菌株在PDA和PCA平板上培养5 d后观察记录菌落形态，待产孢后在显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗、分生孢子链的形态特征，测量并记录分生孢子的大小，每株菌测量30个。为了更清晰地观察病原菌的产孢表型，利用滤纸培养法：滤纸剪成比载玻片小的长方形，中心留1 cm×2 cm的小孔，滤纸铺在载玻片上，挑取PCA培养基上培养的适量菌丝均匀涂抹在滤纸小孔周边，加适量无菌水保湿，置于25℃恒温培养箱中培养5～7 d，中途隔1 d加无菌水保湿，玻片置于体视显微镜下观察产孢表型［6］。

1.4 病原菌的分子生物学鉴定

分离到的菌株在PDA平板上培养7 d后，用灭菌牙签将菌丝刮下，放在1.5 mL的离心管中，采用快速DNA提取试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取DNA。以基因组DNA为模板，分别使用rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）/ITS5（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′）［7］、链格孢属主要过敏原Alt a1基因引物AltF（5′ATGCAGTTCACCACCATCGC3′）/AltR（5′ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC3′）［8］和甘油醛3磷酸脱氢酶gpd基因引物 gpd1（5′CAACGGCTTCGGTCGCATTG3′）/gpd2（5′GCCAAGGAGTTGGTTGTGC3′）［9］进行PCR扩增，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR产物由北京博迈德基因技术有限公司测序，测序结果拼接后提交GenBank进行比对，并在GenBank 中下载相关参考序列，利用MAFFT 7 软件对所有序列进行比对，利用BioEdit 7.0.9.0软件按照ITS、Alt a1和gpd的顺序进行多基因序列整合后，载入RAxML软件中，用最大似然法（maximum likelihood method， ML）构建系统发育树并进行系统发育分析。

1.5 致病性测定

選取3个代表性菌株于PDA平板上25℃培养5 d后打取直径5 mm的菌饼待用。叶片离体接种：选取健康完整的‘瑞光5号成熟桃树叶片，用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水清洗3次，在灭菌滤纸上晾干备用。分别进行有伤和无伤接种。在叶背主叶脉旁侧接种菌饼，菌丝面朝下，有伤接种用无菌昆虫针刺伤。每个处理5片叶，重复3次，以接种无菌PDA块作为对照。枝条、果实离体接种：选取‘北京14号一年生枝条和幼果期桃果实，采用与叶片同样的消毒方法，枝条用直径5mm的打孔器，果实用无菌昆虫针刺伤后进行有伤接种，每个处理3个枝条和3个果实，重复3次。接种后的叶片、枝条和果实置于接种盒中保湿，在L∥D=12 h∥12 h，温度25℃，相对湿度80%～90%的条件下培养。

活体接种：在温室种植的‘瑞光5号桃树植株上进行，将直径5 mm的菌饼菌丝朝下接种于新梢生长点处，以无菌PDA培养基为对照，每个处理3个新梢，重复3次。接种后置于25℃恒温，相对湿度80%条件下培养。观察记录发病情况，发病后对病组织再次进行分离鉴定，与原始分离株相比较，完成柯赫氏法则验证。

2 结果与分析

2.1 病害田间症状及发病情况

该病害发病部位主要在当年新生枝条的嫩梢顶端，5月开始发现发病枝条，发病初期嫩梢生长点处及周围新叶出现褐色坏死点，随着病情发展，坏死区域逐渐扩大，最终嫩梢顶端出现枯萎干枯，影响次年结果枝的生长发育（图1）。7月调查结果显示，3个果园平均病梢率达到14%，发生较重的果园可达20%。

2.2 病原菌的形态特征

根据分离获得菌株菌落特征，从中选取12个代表性菌株进行形态特征观察，培养初期，菌丝为白色，后期菌落呈灰黑色或墨绿色绒状，背面深橄榄绿或黑色，菌丝发达致密，菌落边缘比较整齐。显微镜下，分生孢子梗呈浅褐色，分生孢子浅褐色或褐色，长椭圆形、卵形、棍棒状或倒梨形，多数有喙，并具有1～5个横隔膜和0～3个纵斜隔膜，大小为（10.1～33.2）μm×（5.6～15.0）μm;分生孢子着生于分生孢子梗顶端或侧面，呈链式生长;在PCA 培养基上培养7 d可以形成超过10个孢子连成的分生孢子链，有分枝，呈树枝状;具有典型链格孢属Alternaria分生孢子的形态特征（图2）。

2.3 病原菌的分子鉴定与系统发育分析

提取12个代表性菌株的菌丝DNA，对rDNAITS、Alt a 1和gpd基因序列进行了PCR扩增，將rDNAITS测序结果在NCBI （https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行BLAST 比对，结果表明，与Alternaria属的相似性为98%～100%。将12个菌株的rDNAITS、Alt a 1和 gpd基因序列提交至GenBank，获得36条序列登录号。基于rDNAITS、Alt a 1和gpd序列构建了系统发育树（图3），12个菌株与链格孢Alternaria alternata聚到同一分支，自举值达到92%。结合形态学特征和分子生物学特征，最终确定引起桃树新叶坏死症状的病原菌为链格孢Alternaria alternata。

2.4 致病性测定与柯赫氏法则验证

选取3个代表性菌株PP190107、PP190201、PP190203进行致病性测定，接种后第7天除对照未发病外，所有离体叶片有伤接种全部发病，其中菌株PP190107致病力最强，无伤接种病斑大小与有伤接种接近（图4a），活体接种PP190107 11 d后出现了与田间相同的新叶坏死症状（图4c）。有伤接种离体枝条和果实后也全部发病，以菌株PP190107致病力最强，接种枝条和果实均出现了明显病斑（图4e、4g），果实症状和桃黑斑病相似。

对上述发病组织进行组织分离，获得的病原菌与原接种菌株一致，依据柯赫氏法则证明接种菌株即为引起桃树新叶坏死症状的病原菌。

3 结论与讨论

本研究通过对北京地区引起桃树新叶坏死新症状的病原进行分离、鉴定、致病性测定以及柯赫氏法则验证，确定了该症状由病原真菌引起，结合形态特征观察和多基因系统进化树分析将病原菌鉴定为链格孢A.alternata。这是首次发现链格孢A.alternata能引起新叶坏死症状。

对于链格孢属Alternaria的鉴定，国内外对该类群属种的分类主要依据为形态特征。与其他真菌相比，链格孢属级形态特征明显，鉴定到属较为容易，而种级特征变化较小，从形态上鉴定到种较为困难。随着分子生物学技术的发展，真菌不同属种上的分子水平差异也逐渐被发现，并加以利用。越来越多的学者将联合多基因系统发育分析的方法运用到真菌种级别的准确鉴定中。

研究人员在鉴定链格孢属真菌时，根据不同基因序列在链格孢属的种间差异，开发出用于种级鉴定的引物和引物组合，其中Alt a 1和gpd基因的保守性较高，且在链格孢属不同种间遗传信息差异大，可以将链格孢属真菌准确鉴定到种［8，10］。研究人员利用不同的基因组合对链格孢属种级分类进行了研究，刘俏等［11］利用rDNAITS、EF1α和Alt a 1基因序列对病原菌进行了分类鉴定，王启宇等［12］利用rDNAITS、EF1α和βtubulin基因序列将病原菌进行种级鉴定，TAO等［13］和王彩霞等［14］利用Alt a 1和 gpd基因序列对链格孢属真菌进行了种级分类。本文选择ITS、Alt a 1和 gpd等3个基因序列构建了系统发育树，结果显示能很好地将A.alternata与其他种进行区分，说明这3个基因在一定程度上可以反映出种间的进化程度和亲缘关系的远近。

Alternaria是一类重要的植物病原菌，该属是世界范围内引起桃树叶斑病以及果实黑斑病的病原菌，张志铭等［15］、Inoue等［16］、Abata等［17］和Alam等［18］报道了A.alternata是引起桃树黑斑病的病原菌，迄今为止尚未有A.alternata引起桃树新叶坏死症状的相关报道，本研究结果提示链格孢A.alternata在桃树上能够引起更加复杂多样的症状。分离获得的3个A.alternata菌株在致病性测定中表现出明显差异，其中菌株PP190107具有强致病力，提示不同A.alternata菌株在桃树上具有致病力分化情况。本研究为进一步认识链格孢属真菌的致病多样性以及桃树新叶坏死新症状的防治提供了理论依据和新的思路。

参考文献

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