辽宁梨树枝枯病病原菌Diplodia seriata 的分离与鉴定

丁丹丹 刘博 李爽 赵继荣 程国亭 回虹燕 徐成楠

摘要

在辽宁兴城秋子梨栽培园出现一种新型枝干病害，主要症状为枝枯及木质部坏死。为明确梨树枝枯病病原菌的分类地位，本研究从辽宁兴城地区采样，经过菌株分离培养和致病性测定，以及形态学鉴定结合病原菌的ITS、EF1α和βtubulin多基因联合构建系统发育树，确定引起秋子梨枝枯病的病原菌为色二孢Diplodia seriata。研究结果为明确色二孢引起的辽宁梨树枝枯病发生规律和防治措施的制定提供了理论基础。

关键词

梨树; 枝枯病; 系统发育分析; 色二孢

中图分类号：

S 436.612

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022045

Isolation and identification of the pathogen Diplodia seriata causing stem blight disease on pear in Liaoning

DING Dandan， LIU Bo， LI Shuang， ZHAO Jirong， CHENG Guoting， HUI Hongyan， XU Chengnan*

（College of Life Science， Yanan University， Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube，Yanan 716000， China）

Abstract

A new stem disease on Pyrus ussuriensis orchard with typical symptoms including branches dieback and xylem necrosis was observed in Xingcheng city， Liaoning province. In order to clarify the pathogen causing stem blight disease on pear in Liaoning， samples were collected， meanwhile， isolates were purified and Kochs postulation was carried out. Based on morphological features and combined gene sequence analysis on ITS， EF1α and βtubulin， the causal pathogen of this new disease was identified to be Diplodia seriata. Our results provided a theoretical basis for further research on the disease epidemic and control strategy of stem blight disease on P.ussuriensis in Liaoning.

Key words

pear; stem blight; phylogeny analysis; Diplodia seriata

梨是世界性主要果樹品种之一，我国梨树种植面积和产量继苹果和柑橘之后居第三位［1］。梨树在我国种植范围广泛，根据国家统计局统计数据，截至2020年底，我国梨栽植面积达94万hm2，总产量达到1 781万t，居全球首位。辽宁是我国梨栽培第二大省，秋子梨Pyrus ussuriensis Maxim.、白梨P.bretschneideri Rehd.、西洋梨P.communis L.和沙梨P.pyrifolia （Burm.F.） Nakai四大系统均有分布。很多特色梨品种在国内外均享有盛誉［2］。梨轮纹病、枝枯病和溃疡病长期危害我国北方梨产区，近年来作者曾在辽宁省兴城地区发现间座壳Diaporthe nobilis侵染‘锦丰梨引起枝枯症状［3］。随着辽宁省矮砧密植梨树新栽培模式的发展，真菌侵染引起的枝干病害日趋严重，甚至造成幼树死亡，影响当地梨树矮砧密植新栽培模式的广泛推广。

2019年8月，作者在辽宁省兴城市一个矮化栽培梨园发现一种新病害，症状主要表现为当年生枝条枯萎、主干木质部坏死，该病害的发生严重影响新建梨园幼树的成活率，阻碍了辽宁兴城地区矮砧密植梨树产业的发展。因此，本研究在对辽宁秋子梨树枝枯病害进行调查的基础上，对症状进行了详细描述，对采集的病样进行分离纯化，结合真菌形态学及分子生物学技术对其病原菌进行鉴定，明确该病原种类归属，以期为该病害的发生流行规律及防治策略研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2019年8月在辽宁省兴城市梨树枝枯病发生严重梨园进行调研采样。梨园栽培模式为矮化密植新型栽植方式，砧木为杜梨Pyrus betulifolia Bunge，嫁接接穗为秋子梨。采集具有梨树枝枯病典型症状的患病枝条，观察拍照并记录病害症状特征。

供试培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和2%水琼脂培养基（WA）。其他材料包括：灭菌松针30根;2×Taq MasterMix、DNA marker DL2000，康为世纪公司;CTAB、Tris、EDTA、琼脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 病原菌的分离

采用常规组织分离法分离病原。从发病枝条的病健交界处切取5 mm × 5 mm大小组织块，用清水洗净后，先用75%乙醇表面消毒45 s，再用无菌水漂洗2次后置于PDA培养基上于25℃黑暗培养。挑取菌丝体进行纯化，将纯化后的菌株4℃保存于延安大学生命科学学院植物病原真菌学与病害综合防治研究室。选取代表性菌株pearbot1进行后续试验。

1.3 分离株致病性测定

采用有伤和无伤接种方式测定pearbot1对梨树枝条和果实的致病性。选择健康的当年生秋子梨枝条及果实备用，将枝条截为25 cm长枝段，用无菌水清洗后用75%乙醇表面消毒，两端封蜡。自然风干后使用4 mm打孔器在枝段及果实表皮打上圆形伤口并去掉皮层，同时用4 mm打孔器打取病菌菌丝块，菌丝面贴至有伤或无伤枝条以及果实伤口表面。以接种PDA作为对照。接种后枝条置于搪瓷盘中用塑料膜密封，果实置于塑料密封盒中，25℃恒温保湿培养。有伤、无伤枝条及果实分别接种3根枝条及3个果实，每枝条和果实设置3个接种点并均匀分布，重复3次。逐日观察记录枝条及果实发病情况，待接种试材出现症状后，再次进行组织分离培养并用形态学方法鉴定病原菌。

1.4 病原菌形态学鉴定

将菌株pearbot1接种于PDA平板上，25℃恒温黑暗培养7 d，观察并记录菌落生长特性，同时将菌株接种于含有灭菌松针的2%水琼脂培养基上进行诱导产孢观察。待病原菌产孢后，挑取分生孢子器制成臨时玻片，用显微镜观察其形态，拍照并测量分生孢子大小，与文献报道的相关病原菌进行比对分析。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

收集培养7 d的病原菌菌丝体，采用改良的CTAB法［4］提取菌丝DNA。分别利用真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′），EF1

728F（5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）和EF1986R（5′TACTTGAAGGAACCCTTACC3′），Bt2a（5′GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3′）和Bt2b（5′ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3′）对病原菌的rDNAITS、EF1α和βtubulin基因进行扩增;扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的基因序列在NCBI数据库进行BLAST比对，并提交序列至GenBank。下载GenBank中已发表的色二孢及葡萄座腔菌相关菌株序列信息，利用MEGA 7.0软件的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建3基因联合系统发育树。构建系统发育树所用菌株及登录号见表1。

2 结果与分析

2.1 病害田间调查与病原菌分离纯化

2019年至2020年对辽宁省兴城市梨树枝枯病田间病害发生情况调查表明，该病害主要危害梨树主干和当年生幼嫩枝条，并且主要危害新建梨园中2～3年生幼树，梨园病株率为25%。当年生梨树枝条染病部位黑褐色，病斑呈梭形沿枝条上下扩展。梨树主干枝枯症状多在矮化砧木处开始发生，病原菌从矮化砧木修剪伤口处侵染，沿主枝维管束组织扩展，导致主干枝条组织坏死，枝干外部呈现棕褐色至黑褐色病斑，病斑偶尔凹陷，发病梨树枝干组织表面着生黑色小颗粒状物即为病原菌的子实体。发病严重的梨树整株枯死，将枝条横切后，可见木质部一侧维管束组织坏死，变为棕褐色或黑色（图1）。通过对发病枝条组织分离培养，获得形态学表现一致的疑似病原分离株25株，编号为pearbot1～pearbot25。选取代表性菌株pearbot1进行后续试验。

2.2 分离株致病性测定

在健康梨树有伤离体枝条和果实表面接种分离株pearbot1均可引致枝枯病症状的发生。梨树离体枝条接种后2 d，接种点部位出现黑褐色水渍状病斑，病斑凹陷并向两端扩展，5 d后接种枝条一侧木质部组织变为黑色。果实接种后2 d，接种点部位呈圆形黑褐色水渍状病斑，切开发病果实，可见果肉组织变为黑褐色。无伤接种以及接种PDA的对照枝条及果实未出现任何症状（图2）。从接种后发病的枝条及果实上重新分离到该病原菌，根据柯赫氏法则，分离株是引起梨树枝枯病的病原菌。

2.3 病原菌形态学鉴定

将代表性分离株pearbot1在PDA平板上25℃暗培养，菌落生长速度较快，培养2 d菌落直径可达8.0 cm。菌落生长初期呈白色，气生菌丝发达，边缘整齐;后期菌落呈灰色至黑色，菌丝呈簇状直立生长，生长至培养皿皿盖处（图3a）。分离株在含灭菌松针的2%水琼脂培养基上培养15 d后产生分生孢子器。分生孢子器散生、单室、近球形、器壁黑色、近炭质;分生孢子单胞、椭圆形、两端钝圆，初期无色透明，后期转为棕色，分生孢子大小为（24.82±3.09）μm ×（10.69±1.15）μm （n=20）（图3b）。根据上述形态学特征将所获病原菌分离株初步鉴定为色二孢属Diplodia真菌。

2.4 病原菌多基因序列系统发育分析

扩增代表菌株pearbot1核糖体内转录间隔区序列（ITS）、α延伸因子序列（EF1α）和微管蛋白序列（βtubulin），分别得到大小为555、260 bp和432 bp的基因片段。BLAST序列比对结果显示，菌株的3段保守基因分别与色二孢Diplodia seriata相关基因相似性达到99%，将所有序列提交至GenBank数据库，获得登录号分别为OM018671、OM063100和OM063099。

下载NCBI数据库中色二孢属以及葡萄座腔菌科其他属相关物种的ITS、EF1α和βtubulin相关序列，利用MEGA软件选择最大似然法构建系统发育树。从图4可以看到分离株pearbot1与色二孢的模式菌株CBS121885T、CBS112876T和CBS112555T的序列聚在同一个分支，而与其他种亲缘关系较远，该独立分支自举支持率达到100%（图4）。结合菌株的形态学特征，将该病原菌鉴定为色二孢Diplodia seriata。

3 结论与讨论

本研究对辽宁省兴城市矮化密植梨园中的梨树枝枯病进行病害诊断，分离获得病原菌分离株并且在梨树枝条和果实上验证了其致病性。通过传统真菌形态学特征结合多基因的系统发育分析对病原菌进行了鉴定，确定引致该病害的病原菌为色二孢 Diplodia seriata，田间病害调研及实验室病菌培养过程中均未发现其有性阶段。

Diplodia seriata是葡萄座腔菌科真菌中的重要一员，广泛分布于世界上大多数热带及温带地区［56］。D.seriata是一种重要的植物病原真菌，寄主范围十分广泛，可以侵染梨和苹果等多种植物的枝干和果实，引起叶斑病、果实黑腐病、枝干溃疡及枝枯病等多种病害，造成巨大的经济损失［78］。近年来，色二孢属真菌作为葡萄、苹果和梨树等重要经济果树病原菌在国内外被广泛报道［911］，D.seriata引起梨树溃疡和枝枯等症状分别在中国、土耳其和美国有发生报道［5， 1314］。由于葡萄座腔菌科真菌极少在田间和实验室内产生有性阶段，该科真菌分类主要依赖无性型分生孢子器和分子孢子形态特征［1516］。随着DNA序列分析及多基因分子系统学的发展，基于形态学特征和分子特征的该科真菌系统分类逐渐得到了广泛应用，也极大地促进了植物病原真菌系统分类学的发展［17］。我们在田间调研发现，矮砧密植栽培秋子梨时，矮化砧木存在剪锯口，而伤口是该病原菌侵染的重要途径。Slippers等［18］的研究表明，D.seriata等葡萄座腔菌科真菌通常作為一种弱寄生菌或内生真菌存在于寄主体内，在本研究中仅有伤枝条接种发病也印证了这一观点，因此在梨树枝枯病的防治过程中更应高度重视梨树砧木嫁接伤口的保护，避免病原菌从该处侵入寄主危害主干。本文研究结果为进一步探索由色二孢引起的梨树枝枯病的致病机制和综合防治提供了理论基础。

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（責任编辑：田 喆）