汉防己甲素对5种植物病原真菌的抑制作用及对灰葡萄孢的作用机制初探

王雨 王鑫伟 刘洋 刘楚涵 钱怡云 宋萍萍 韦敏

摘要

为寻找环境友好型的农药先导化合物，利用菌丝生长速率法研究了粉防己中汉防己甲素对常见植物病原真菌的抑制活性，结果表明，汉防己甲素对5种常见植物病原真菌均有抑制作用，对立枯丝核菌的抑制作用最强，EC50为33.49 mg/L;对串珠镰孢和瓜类黑腐球壳菌的EC50分别为41.71 mg/L和43.97 mg/L，抑制活性优于对照植物源药剂蛇床子素;对灰葡萄孢的抑制活性与蛇床子素相当。接种蓝莓离体叶片的试验结果表明，汉防己甲素对蓝莓灰霉病具有治疗和保护作用且作用效果与对照药剂蛇床子素基本相当;激光共聚焦显微镜检测发现汉防己甲素可降低灰葡萄孢菌丝内钙离子浓度，汉防己甲素分别与CaCl2及钙通道阻滞剂维拉帕米两者相互作用可降低灰葡萄孢对各药剂的敏感性，表明其作用机制与钙离子及钙离子通道有关。本文首次报道汉防己甲素对5种植物病原真菌的抑制作用及其作用机制，为其进一步的开发应用提供理论基础。

關键词

汉防己甲素; 植物病原真菌; 灰葡萄孢; 钙离子; 钙离子通道

中图分类号：

S 482.292

文献标识码： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022343

Inhibitory effect of tetrandrine on five plant pathogens and its mechanism on Botrytis cinerea

WANG Yu1， WANG Xinwei1， LIU Yang1， LIU Chuhan2， QIAN Yiyun1， SONG Pingping1*， WEI Min1*

（1. Jiangsu Key Laboratory for the Research and Utilization of Plant Resources， Institute of Botany， Jiangsu Province and

Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

Abstract

In order to search for more effective environmentfriendly fungicide lead compounds， sensitivity of tetrandrine on five plant pathogens were determined by mycelium growth rate method. The results showed that tetrandrine had antifungal activity against all tested pathogens， displayed a strong antifungal activity against Rhizoctonia solani isolate （EC50=33.49 mg/L）， exhibited a higher activity against Fusarium moniliforme isolate（EC50=41.71 mg/L） and Didymella bryoniae isolate（EC50=43.97 mg/L） than osthole， and showed significant activity against Botrytis cinerea equal to osthole. The results of inoculation of blueberry leaves in vitro showed that tetrandrine had both therapeutic and protective activities against gray mold infections， equal to those of osthole. Laser confocal microscopy showed that tetrandrine could reduce the concentration of calcium ions in the mycelia of B. cinerea， and the interaction of tetrandrine with CaCl2 and calcium channel blocker verapamil could reduce the sensitivity of B. cinerea to each reagent， indicating that the mechanism of tetrandrine against B. cinerea was related to Ca2+ and Ca2+ channels. Our work represents the first report of the antifungal properties of tetrandrine against five plant pathogens and its mechanism， providing a theoretical basis for its further development and application.

Key words

tetrandrine; plant pathogens; Botrytis cinerea; Ca2+; Ca2+ channel

植物病原菌引起的植物病害严重影响农作物的产量和品质，是农业发展面临的问题之一，多年来人们解决这一问题的主要方式是化学防治，但近年来化学防治带来的食品安全、环境污染及抗药性问题愈发突出［1］，因此亟须研发新型、安全、环保的防治药剂及绿色防控技术。已有研究证实植物中多种天然化合物对植物病原菌具有较好的抑制作用［23］，这些化合物因作用方式特异、不易产生抗药性、环境友好、对非靶标生物相对安全等特点逐渐引起人们的关注［4］。

汉防己甲素又称粉防己甲素，是从防己科千金藤属植物粉防己Stephania tetrandra S. Moore根茎中提取的一种生物碱，为中药粉防己的主要活性成分之一［5］。现代药理学研究发现汉防己甲素具有心血管保护、神经保护、抗肝纤维化、镇痛、降压、降血糖和抗自由基损伤等多种药理作用，临床上主要用于治疗尘肺病、风湿痛、关节痛、神经痛等［56］。文献报道汉防己甲素可抑制金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、白色念珠球菌Candida albicans等细菌和真菌［78］，但在抑制植物病原真菌方面的研究未见有报道。基于此，本研究选用粉防己为原料，从中提取分离得到汉防己甲素，采用菌丝生长速率法测试了其对常见植物病原真菌的抑制活性，初步探讨了汉防己甲素对灰葡萄孢的抑菌作用机制，为基于天然产物的植物源抑菌剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

粉防己块根：购自南京益丰大药房，将块根粉碎成粉末状，过三号筛，保存备用。

供试真菌：立枯丝核菌Rhizoctonia solani，分离自水稻纹枯病病叶;灰葡萄孢Botrytis cinerea，分离自草莓灰霉病病株;禾谷镰孢Fusarium graminearum，分离自小麦赤霉病病株;串珠镰孢Fusarium moniliforme，分离自水稻恶苗病病株;瓜类黑腐球壳菌Didymella bryoniae，分离自西瓜蔓枯病病株;供试菌株均由南京农业大学植物保护学院馈赠。

供试植物：‘蓝莓1号植株栽培于江苏省中国科学院植物研究所温室中。

1.2 仪器与药剂

仪器：METTLER AE240电子天平，梅特勒托利多仪器公司;高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂;SWCJIFD可调式垂直单向洁净

工作台，上海天恒医疗器械有限公司;SPX150BSHⅡ

生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司;Agilent

1260 UPLCDAD6530 ESIQTOF MS

液质联用仪，美国安捷伦公司;核磁共振谱仪，Bruker Avance 300;X6显微熔点测定仪，北京泰克仪器有限公司;摇床，上海智城分析仪器制造有限公司;

Zeiss LSM 900

激光扫描共聚焦显微镜，蔡司公司。

试剂：98%汉防己甲素，陕西绿清生物工程有限公司;98%蛇床子素，四川省维克奇生物科技有限公司;

瓊脂、PBS，北京索莱宝科技有限公司;DMSO、葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司;氯化钙，广东光华科技股份有限公司;

Fluo3 AM（钙离子荧光探针，5 mmol/L），碧云天生物技术有限公司;薄层层析硅胶，青岛海洋化工厂分厂;维拉帕米、色谱纯甲醇、色谱纯乙腈，阿拉丁公司;其他试剂均为分析纯。

PDA固体培养基： 200 g去皮马铃薯切块，煮沸10 min后，取汁，加入20 g琼脂，加热至融化，再加入20 g葡萄糖，用去离子水定容至1 L。

PD培养液： 200 g去皮马铃薯切块，煮沸10 min 后，取汁，加入20 g葡萄糖，用去离子水定容至1 L。

含钙PDA培养基：取刚做好的PDA培养基，称取氯化钙加入其中，制成氯化钙终浓度分别为40 000 mg/L 和50 000 mg/L 的含钙培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 粉防己根中汉防己甲素的提取分离纯化与鉴定

准确称取粉防己块根粉2.0 kg，75%乙醇热回流提取，滤过，滤液浓缩成浸膏，加水溶解后二氯甲烷萃取3次，合并有机溶剂后浓缩成浸膏，浸膏溶解，粗硅胶拌样，柱层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇 （20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1）梯度洗脱，硅胶板检测，将含有与汉防己甲素标准品化学位移值相同的溶液合并，反复硅胶柱层析制备得到汉防己甲素粗品，重结晶后制得的固体用丙酮溶解，加水沉析制备得到的晶体经HPLCMS质谱及氢谱数据并与标准品比对鉴定得到纯度98%以上的汉防己甲素［911］，用制备得到的汉防己甲素作为供试品进行试验。

1.3.2 菌丝生长速率法测定汉防己甲素的抑菌活性

采用菌丝生长速率法［12］测定汉防己甲素抑制植物病原菌的EC50。用二甲基亚砜（DMSO）将汉防己甲素配成母液（104mg/L）后加入PDA培养基中，制成含有5个浓度梯度的含药平板（d=9 cm），以蛇床子素原药为阳性对照，以加入相应DMSO溶剂为空白对照。将供试病原菌菌饼（直径为 0.5 cm）分别接种于含药PDA平板中央，每皿1块菌饼，菌丝面向下。接种后将培养皿用保鲜膜密封后放置于24 ℃培养箱中黑暗培养3～12 d，待对照组菌丝长至超过平板直径2/3时，用十字交叉法测量菌落直径，利用DPS软件计算抑制中浓度EC50及斜率，用GraphPad Prism 8进行卡方检验。每处理重复3次，试验重复3次。

1.3.3 采用离体叶片法测定汉防己甲素对灰霉病的保护和治疗作用

保护作用测定［13］：采摘新鲜的蓝莓叶片用水洗净晾干，分别喷洒用含有0.1% 吐温80的去离子水稀释的浓度为0、20、40、60、80、100 mg/L的化合物，将叶片放置于底部有湿润滤纸的培养皿中，于24 ℃培养箱中黑暗培养。24 h后，挑取灰葡萄孢菌饼（直径0.5 cm）接种于各试验组长势基本一致的蓝莓叶片中央部位。将接种后的培养皿置于24 ℃培养箱中黑暗培养，3 d后，用十字交叉法测定病斑直径，计算防治效果。每处理10个重复，试验重复2次。

治疗作用测定［13］：采摘新鲜的蓝莓叶片用水洗净晾干后，将灰葡萄孢菌饼（直径0.5 cm）接种于各试验组长势基本一致的蓝莓叶片中央部位，将叶片放置于底部有湿润滤纸的培养皿中，置于24 ℃培养箱中黑暗培养。24 h后，分别喷洒用含有0.1%吐温80的去离子水稀释的浓度为0、20、40、60、80、100 mg/L的化合物，培养3 d后，用十字交叉法测定病斑直径，计算防治效果。每处理10个重复，试验重复2次。

防治效果=（对照组病斑直径-处理组病斑直径）/（对照组病斑直径-0.5）×100%。

1.3.4 外源性钙离子对汉防己甲素抑菌作用的影响

采用菌丝生长速率法测定外源性钙离子对汉防己甲素抑菌作用的影响［12，14］。制备含不同浓度CaCl2（40 000、50 000 mg/L）、汉防己甲素（30 mg/L）及二者联用的含药培养基，以加入相应DMSO溶剂为空白对照组，将供试病原菌菌饼（直径为 0.5 cm）分别接种于含药平板上，保鲜膜密封后置于24 ℃培养箱中黑暗培养3～4 d，观察菌丝生长情况，用十字交叉法测量菌落直径，计算各药剂对各病原菌的生长抑制率。

1.3.5 激光共聚焦顯微镜检测汉防己甲素对灰葡萄孢菌丝内钙离子浓度的影响

Fluo3 AM作为最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一，可穿透细胞膜被剪切成Fluo3，继而与钙离子结合产生较强的荧光，且荧光在一定时间内强度恒定［15］，因此可用来观察药剂对钙离子浓度的影响。将5个灰葡萄孢菌饼（直径为0.5 cm）接入150 mL PD培养液中，于24℃、125 r/min摇培60 h，夹取灰葡萄孢菌丝于培养皿中，PBS洗3次，放置于含有3 μL Fluo3 AM钙离子探针的500 μL PBS的EP管中避光冰水浴超声30 min，激光共聚焦显微镜检测后有荧光。放入含100 mg/L汉防己甲素的PBS溶液中，用激光共聚焦显微镜观察药剂处理过的菌丝体内钙离子浓度的变化［14］。设置激发波长488 nm，发射波长525 nm，分别在5、10 min时进行观察。以相应溶剂处理菌丝作为对照组，每处理设3次重复。

1.3.6 钙通道拮抗剂维拉帕米对汉防己甲素抑菌作用的影响

采用菌丝生长速率法测定钙通道拮抗剂维拉帕米对汉防己甲素抑菌作用的影响［12］。制备含200 mg/L维拉帕米（去离子水为溶剂）、40 mg/L汉防己甲素及二者联用的含药培养基，以加入相应DMSO溶剂为空白对照组，将供试病原菌菌饼（直径为 0.5 cm）分别接种于含药平板上，保鲜膜密封后置于24 ℃培养箱中黑暗培养3～4 d，观察菌丝生长情况，用十字交叉法测量菌落直径，计算各药剂对各病原菌的生长抑制率。

2 结果与分析

2.1 汉防己甲素的鉴定

白色粉末，m.p.223～224.1 ℃（文献［911］：216～222℃）。ESIMS （m/z）：623.38［M+H］+，分子式为C38H42N2O6。

1HNMR（400 MHz， CDCl3）δ：2.34（s， 3H），2.38～2.40（m， 1H），2.48（d， J=33.8， 13.8 Hz， 1H），2.63（s， 3H），2.67～3.12（m， 6H），3.19（s， 3H），3.27（dd， J=12.3，5.2 Hz， 1H），3.37（s， 3H），3.38～3.40（m， 1H），3.46～3.48（m， 1H），3.75（s， 4H），3.88（dd， J=10.8，5.6 Hz， 1H），3.93（s， 3H），6.00（s， 1H），6.29（s， 1H），6.30（s， 1H），6.53（d， J=13.1 Hz， 2H），6.80（d， J=8.3 Hz， 1H），6.86（d， J=8.1 Hz， 1H），6.89（d， J=8.2 Hz， 1H），7.15（d， J=8.1， 2.5 Hz， 1H），7.35（d， J=8.2， 2.0 Hz， 1H）。

1HNMR谱数据、质谱数据、熔点数据与文献［911］一致，故該化合物鉴定为汉防己甲素（tetrandrine）。经HPLCMS测定标准品及提取分离纯化的汉防己甲素纯度均超过98%。

2.2 汉防己甲素的抑菌活性

2.2.1 汉防己甲素对5种常见病原菌的EC50

按照1.3.2抑菌活性测试方法测定汉防己甲素对5种植物病原菌的EC50结果如表1所示。在5种植物病原真菌中，汉防己甲素对禾谷镰孢的抑制活性较低，对其他4种植物病原菌的抑制活性较好，对立枯丝核菌的抑制活性最强（EC50=33.49 mg/L）;对串珠镰孢、瓜类黑腐球壳菌的EC50分别为41.71 mg/L和43.97 mg/L，抑制活性优于对照药剂蛇床子素;对灰葡萄孢的抑制活性与对照药剂蛇床子素相当。

2.2.2 离体条件下汉防己甲素对灰霉病的保护和治疗作用

保护作用的防效测定结果显示（表2），在用药浓度为20、40、60 mg/L时，汉防己甲素与对照药剂蛇床子素的作用效果无明显差异，用药浓度为80、100 mg/L时，蛇床子素的作用效果较好;保护作用的防治效果随用药浓度增加而增强，且本试验用药浓度的保护防效均在43%以上。

治疗作用的防效测定结果显示（表2），在用药浓度为20 mg/L时，蛇床子素的作用效果较好，用药浓度为40、60、80、100 mg/L时，汉防己甲素与对照药剂蛇床子素之间的作用效果无显著差异;治疗作用的防治效果均随用药浓度增加而增强，且本试验用药浓度的治疗效果均在41%以上。

2.3 汉防己甲素抑菌作用机制初探

2.3.1 外源性钙离子对汉防己甲素抑菌作用的影响

由表3数据可知，汉防己甲素单独使用时对灰葡萄孢的抑制率为26.46%，浓度为40 000 mg/L的CaCl2单独使用时抑制率为40.54%，但二者混合使用时抑制率为40.27%，与CaCl2单独使用时的抑制率相近;当添加的CaCl2浓度为50 000 mg/L时抑制率为56.01%，联合使用后抑制率变为49.48%，较CaCl2单独使用的抑制率没有上升反而明显下降。两个结果都说明汉防己甲素的抑菌活性与CaCl2的抑菌活性没有相加作用，汉防己甲素可降低灰葡萄孢对CaCl2的敏感性，因此推断汉防己甲素的抑菌作用机制与钙离子有关。

2.3.2 利用激光共聚焦显微镜检测汉防己甲素对灰葡萄孢菌丝内钙离子浓度的影响

为进一步确定汉防己甲素对灰葡萄孢菌丝内钙离子的影响，通过激光共聚焦显微镜进行观察。本试验加入Fluo3 AM 后2 h内用激光共聚焦显微镜观察灰葡萄孢菌丝荧光强度未发现有变化，而加入汉防己甲素后荧光强度明显减弱（如图1所示），表明灰葡萄孢菌丝内钙离子浓度降低，且观察时间越长，降低程度越明显。此结果说明汉防己甲素对灰葡萄孢的抑菌作用与钙离子有关。

2.3.3 钙通道拮抗剂维拉帕米对汉防己甲素抑菌作用的影响

由表4数据可知，汉防己甲素单独使用时对灰葡萄孢的抑制率为37.19%，维拉帕米单独使用时抑制率为44.79%，但二者混合使用时抑制率为51.86%。此结果说明汉防己甲素的抑菌活性与维拉帕米的抑菌活性并不是单纯的相加作用，两者相互作用可降低灰葡萄孢对各自的敏感性，因此可推断出汉防己甲素的抑菌作用机制也与钙通道有关。

3 结论与讨论

汉防己甲素具有心血管保护、降压、降血糖等多种药理作用［56］，还可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等细菌和真菌［78］，但在抑制植物病原真菌方面的研究未见有报道。本试验以粉防己块根为原料进行提取分离纯化得到含量为98%以上的汉防己甲素，采用菌丝生长速率法对其抑菌活性进行研究，发现其对供试病原真菌均有抑制作用，且汉防己甲素对灰霉病的保护和治疗作用效果与对照药剂蛇床子素相当，有进一步研究的价值。

汉防己甲素为一种非选择性的钙离子通道阻滞剂，动物细胞试验表明，其可调节细胞外Ca2+内流，平衡细胞内外Ca2+浓度，维持Ca2+在内环境的稳态等［1619］。真菌中，Ca2+可调控很多内在的代谢及外在环境刺激过程，如细胞周期、孢子萌发、菌丝顶端生长、生物钟以及渗透胁迫、热休克、机械刺激及氧化胁迫等［2023］。目前钙/钙调神经磷酸酶信号通路已被认为是抗菌剂的潜在作用靶标［24］，通路中有Ca2+通道蛋白、钙调磷酸酶等重要蛋白。钙离子通道阻滞剂作用于Ca2+通道蛋白，加入钙通道阻滞剂可以影响真菌的正常生理过程，例如 Shaw 等报道钙拮抗剂可降低叶点霉Phyllosticta ampelicida分生孢子萌发率和附着胞的形成率［22］，钙拮抗剂维拉帕米可使胃肠道定殖的白色念珠菌细胞显著减少［25］。汉防己甲素已被证明为钙离子通道阻滞剂，作用于钙通道蛋白，故推测其抑菌作用机制可能与Ca2+和Ca2+通道蛋白有关。基于此，本文研究了添加外源性Ca2+及钙通道阻滞剂维拉帕米对汉防己甲素抑菌活性的影响，并通过激光共聚焦显微镜检测汉防己甲素对灰葡萄孢菌丝内钙离子浓度的影响，结果证明汉防己甲素对灰葡萄孢的抑菌作用机制与钙离子及钙离子通道有关。

汉防己甲素是防己科千金藤属植物粉防己中分离提取的双苄基异喹啉类生物碱，已作为临床药物用于抗风湿及阵痛、抗肺癌、抗矽肺等。虽然已开展了许多工作，但对于抑制植物病原真菌方面的研究未见有报道。本文首次发现汉防己甲素具有抑制植物病原真菌的作用，并对其抑菌作用机制进行了初步探索，为进一步开发高效低毒的新型杀菌剂提供理论基础。

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（責任编辑：田 喆）