防治葡萄溃疡病的杀菌剂筛选与评价

刘梅 金添 王慧 李永华 王训成 李兴红 燕继晔

摘要

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了7种杀菌剂对可可毛色二孢CSS01s的室内生物活性，筛选出3种抑制效果较好的杀菌剂;通过对离体葡萄绿枝条及盆栽葡萄幼苗新梢进行人工接种病原菌，进一步评价杀菌剂的防治效果。结果表明，7种杀菌剂对可可毛色二孢菌丝生长和孢子萌发表现出不同的抑制活性，其中戊唑醇、氯氟醚菌唑、啶酰菌胺和氟啶胺对菌丝生长的抑制作用较强，EC50分别为0.116、0.137、0.109 μg/mL和0.119 μg/mL;戊唑醇、氯氟醚菌唑、氟啶胺对孢子萌发的抑制作用较强，EC50分别为0.420、0.595 μg/mL和1.885 μg/mL。CSS01s接种离体葡萄绿枝条试验中，戊唑醇100、200 mg/L，氯氟醚菌唑100、300 mg/L和氟啶胺100、200 mg/L的防治效果无显著差异，在57.81%～65.31%;CSS01s接种葡萄幼苗新梢试验中，氟啶胺200 mg/L的防治效果最好，为77.56%，与氟啶胺100 mg/L、氯氟醚菌唑100、300 mg/L和戊唑醇200 mg/L之间无显著差异，但显著高于戊唑醇100 mg/L。研究结果显示，氯氟醚菌唑、戊唑醇和氟啶胺可以作为推荐杀菌剂，经进一步的田间藥效评价用于葡萄溃疡病的防治。

关键词

葡萄溃疡病; 可可毛色二孢; 杀菌剂; 室内生物活性; 防治效果

中图分类号：

S 436.631.1

文献标识码： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022144

Screening and evaluation of fungicides for controlling grapevine Botryosphaeria dieback

LIU Mei， JIN Tian， WANG Hui， LI Yonghua， WANG Xuncheng， LI Xinghong， YAN Jiye*

（Beijing Key Laboratory of Environment Friendly Management on Fruit Diseases and Pests in North China， Institute

of Plant Protection， Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Beijing 100097， China）

Abstract

Inhibitory activities of seven fungicides to Lasiodiplodia theobromae were determined using the mycelial growth and conidia germination methods. Three fungicides with high inhibitory effect were screened out， including tebuconazole， mefentrifluconazole and fluazinam. Control efficacy was further evaluated by CSS01s inoculation in vitro grape green shoot and seedling branch. The results showed that all the seven fungicides presented different inhibitory activity against both mycelial growth and conidia germination. For the mycelial growth， the highest inhibitions were found in the cases with tebuconazole， mefentrifluconazole， boscalid， and fluazinam， with EC50 values of 0.116， 0.137， 0.109， and 0.119 μg/mL， respectively. For the conidia germination， the highest inhibitions were found in the cases with tebuconazole， mefentrifluconazole and fluazinam， with EC50 values of 0.420， 0.595 and 1.885 μg/mL， respectively. For the CSS01s inoculation in vitro grape green shoot， control efficacies of tebuconazole （100， 200 mg/L）， mefentrifluconazole （100， 300 mg/L）， and fluazinam （100， 200 mg/L） were no significantly different， and in the range of 57.81%-65.31%. For the CSS01s inoculation seedling branch， the highest control efficacy of fluazinam （200 mg/L） was 77.56%， had no significant difference with that of fluazinam （100 mg/L）， mefentrifluconazole （100， 300 mg/L）， and tebuconazole （200 mg/L）， but significantly higher than that of tebuconazole （100 mg/L）. The above results indicated that tebuconazole， mefentrifluconazole， and fluazinam could be recommended as fungicides for prevention and control of grapevine Botryosphaeria dieback after further evaluation of field efficacy.

Key words

grapevine Botryosphaeria dieback; Lasiodiplodia theobromae; fungicide; inhibitory activity in vitro; control efficacy

葡萄Vitis vinifera L.属于葡萄科葡萄属木质藤本植物，是一种具有重要经济价值的果树，在全球范围内广泛种植。我国是世界第二大种植葡萄的国家，葡萄种植面积约为87.5 万hm2，占全球葡萄种植面积的12%［1］。葡萄及其相关产业在我国农业生产中占有较大的比重。葡萄溃疡病于1964年在加拿大首次报道［2］，是葡萄重要的枝干病害，典型症状包括枝条或枝干顶梢枯死、木质部出现褐色至黑色楔形或弓形坏死斑;另外，田间还可表现为芽坏死、果实干缩脱落等症状，严重时会导致整株枝条或整树枯死。近年来，由于葡萄树龄的增长、种植方式改变以及环境变化、栽培管理等多种原因，葡萄溃疡病发生较为普遍且个别年份较重，平均每年造成葡萄减产3%～8%，在发病较重的省份如广西、浙江等地可导致10%～20%的产量损失，给葡萄产业发展带来不利影响［3］。

國际上报道与葡萄溃疡病有关的病原真菌主要集中于葡萄座腔菌属Botryosphaeria、色二孢属Diplodia、小穴壳属Dothiorella、毛色二孢属Lasiodiplodia、Neofusicoccum、Spencermartinsia和球壳孢属Sphaeropsis 这7个属，其中葡萄座腔菌B.dothidea、色二孢D.seriata、可可毛色二孢L. theobromae和小新壳梭孢N. parvum最为常见［35］。可可毛色二孢的致病力最强［4］，寄主广泛，除危害葡萄外，还可危害猕猴桃［6］、茶树［7］、橡胶等［8］。

针对葡萄溃疡病的防治，国内外学者尝试了热水处理苗木［912］，调整修剪时间［13］、“外科手术治疗”等多种措施［1415］，对控制病害发生和蔓延起到了一定的作用，但从田间的防治效果来说，使用杀菌剂是最有效的措施，一些三唑类杀菌剂（苯醚甲环唑）、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（嘧菌酯）和苯并咪唑类杀菌剂（甲基硫菌灵）已陆续被用于葡萄溃疡病的防治中［16］，但为避免同一化学杀菌剂长期连续使用带来的抗药性问题，需要筛选新型高效的杀菌剂进行轮换或交替使用，同时结合生物防治、物理防治等多种措施建立葡萄溃疡病综合防治技术。本研究通过菌丝生长速率法、孢子萌发法测定了7种杀菌剂对葡萄溃疡病菌的室内生物活性，并通过可可毛色二孢CSS01s接种葡萄离体绿枝条以及盆栽幼苗新梢的方法，筛选出高效低毒的化学药剂，为田间葡萄溃疡病的科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae CSS01s，从湖南葡萄枝干病样上分离获得，并经单孢纯化保存。

供试葡萄品种：‘夏黑。

供试杀菌剂均为原药。97%戊唑醇，上虞颖泰精细化工有限公司;97%氯氟醚菌唑、98%啶酰菌胺和98%吡唑醚菌酯，巴斯夫欧洲公司;96%氟啶胺，日本石原产业株式会社;98%咯菌腈，瑞士先正达作物保护有限公司;95%甲基硫菌灵，日本曹达株式会社;99%水杨肟酸 （SHAM），上海麦克林生化科技有限公司。用丙酮溶剂制备成10 mg/mL的母液，于4℃黑暗条件下保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝生长速率法测定不同杀菌剂的生物活性

用无菌水分别稀释10 mg/mL的母液，配制5个系列质量浓度梯度的含药PDA平板（其中丙酮的体积分数<0.25%），设置空白对照和溶剂对照。为抑制旁路呼吸作用，吡唑醚菌酯的PDA 平板中加入适当体积的水杨肟酸（SHAM）至终浓度为100 μg/mL。将可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培养2 d 后，打取菌龄一致的菌饼接种于含药PDA平板和对照PDA平板中央，每处理重复3次，置于28℃，L∥D=12 h∥12 h的培养箱中培养2 d。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率，将抑制率转换为几率值（y），浓度换算成浓度对数（x），利用 DPS软件求出毒力回归方程的斜率，计算各杀菌剂的EC50及95%置信限并进行卡方检验。试验重复2次。

抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

1.2.2 孢子萌发法测定不同杀菌剂的生物活性

按照1.2.1 的方法制备 5个系列质量浓度梯度的含药水琼脂（WA）平板，设置空白对照和溶剂对照。为抑制旁路呼吸作用，吡唑醚菌酯的WA 平板中加入适当体积的SHAM至终浓度为100 μg/mL。可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培养7 d，待菌丝表面产生大量的分生孢子器，用灭菌棉签打断菌丝并向培养皿中加入5 mL无菌水，而后用4层纱布过滤获得浓度为1 × 106个/mL的孢子悬浮液。分别吸取100 μL孢子悬浮液至含药及不含药的WA平板上，用涂布器涂抹均匀，于28℃，L∥D=12 h∥12 h的培养箱中培养，每处理重复3次，8 h后随机镜检分生孢子的萌发情况（对照孢子萌发率在90%以上时）。当萌发芽管长度超过孢子短半径时视为萌发。计算各处理的分生孢子相对萌发抑制率，以药剂浓度对数值为横坐标，分生孢子萌发抑制率的几率值为纵坐标，利用 DPS软件求出毒力回归方程的斜率，计算各杀菌剂的EC50及95%的置信限并进行卡方检验。试验重复2次。

R=Ng/Nt ×100 （R为孢子萌发率，Ng为孢子萌发数，Nt为调查的孢子总数）;

I=（R0-Rt）/ R0 ×100 （I为孢子萌发抑制率，R0为空白对照孢子萌发率，Rt为处理孢子萌发率）。

1.2.3 杀菌剂对接种CSS01s的离体葡萄绿枝条的防治效果

可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培养2 d，在菌落边缘打取直径4 mm的菌饼。用无菌水分别稀释10 mg/mL的母液，配制系列浓度梯度的药液。取30～35 cm包含4～5节的健康‘夏黑葡萄绿枝条作为接种材料，经表面消毒后，采用电动喷雾器向离体枝条均匀喷洒各浓度的药液，以药液不滴落为宜。对照喷施相同体积的无菌水。施药24 h 后，在距枝条顶端15 cm 处用4 mm灭菌打孔器打孔，去掉韧皮部，将制备的菌饼贴接于伤口处，用封口膜包扎保湿，每个接种后的绿枝条马上插入装有灭菌蛭石营养钵中，每处理5根枝条，3次重复。接菌后放置于28℃，L∥D=12 h∥12 h，前48 h相对湿度80%～90%，后期相对湿度60%的人工气候室中，7 d 后测量病斑长度，计算各杀菌剂各浓度处理对葡萄溃疡病的防效。

防治效果=（对照病斑长度-处理病斑长度）/（对照病斑长度-菌饼直径）×100%。

1.2.4 杀菌剂对接种CSS01s盆栽葡萄幼苗新梢的防治效果

将可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培养2 d，在菌落边缘打取直径4 mm的菌饼。用无菌水分别稀释

10 mg/mL的母液，

配制系列浓度梯度的药液。选取温室盆栽‘夏黑葡萄长约40 cm，直径10 mm左右，包含4～5节的健康葡萄新梢作为接种材料，采用电动喷雾器向整条新梢均匀喷洒各浓度的药液，以药液不滴落为宜。对照喷施相同体积的无菌水。施药24 h 后，在距枝条顶端15 cm 处用4 mm灭菌打孔器打孔，去掉韧皮部，将制备的菌饼贴接于伤口处，用封口膜包扎保湿，每处理5根枝条，3次重复。培养条件同1.2.3小节。10 d 后测量病斑长度，计算各杀菌剂各浓度处理对葡萄溃疡病的防效。

防治效果=（对照病斑长度-处理病斑长度）/（对照病斑长度-菌饼直径）×100%。

2 结果与分析

2.1 杀菌剂对可可毛色二孢CSS01s的生物活性

供试杀菌剂对可可毛色二孢CSS01s菌丝生长均具有不同程度的抑制作用，其中戊唑醇、氯氟醚菌唑、啶酰菌胺、氟啶胺的抑制作用较强，EC50分别为0.116、0.137、0.109 μg/mL和0.119 μg/mL，其次是吡唑醚菌酯和咯菌腈，甲基硫菌灵对菌丝生长的抑制作用最低，EC50为0.776 μg/mL（表1）。

供试杀菌剂对可可毛色二孢CSS01s孢子萌发均具有不同程度的抑制作用，其中戊唑醇、氯氟醚菌唑和氟啶胺的抑制作用较强，其EC50分别为0.420、0.595 μg/mL和 1.885 μg/mL，其次是咯菌腈和甲基硫菌灵，啶酰菌胺和吡唑醚菌酯对孢子萌发的抑制作用最低，EC50分别为7.961 μg/mL和10.935 μg/mL（表2）。

2.2 杀菌剂对可可毛二孢CSS01s接种离体葡萄绿枝条和盆栽葡萄幼苗新梢的防治效果

3種杀菌剂对葡萄溃疡病具有一定的防治效果，但在低质量浓度50 mg/L下对葡萄绿枝条的防治效果均低于25%，随着杀菌剂浓度的提高，防治效果增加。CSS01s接种离体葡萄绿枝条试验中，戊唑醇100、200 mg/L，氯氟醚菌唑100、300 mg/L和氟啶胺100、200 mg/L防治效果无显著差异，防效在57.81%～65.31%;CSS01s接种葡萄幼苗新梢试验中，氟啶胺200 mg/L的防治效果最高，为77.56%，与氟啶胺100 mg/L、氯氟醚菌唑100、300 mg/L和戊唑醇200 mg/L的防效无显著差异，显著高于戊唑醇100 mg/L的防效（表3）。

3 结论与讨论

本试验采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了7种杀菌剂对可可毛色二孢的室内生物活性，结果表明，戊唑醇、氯氟醚菌唑和氟啶胺对菌丝生长和孢子萌发的抑制活性较高。接种试验结果表明，戊唑醇、氯氟醚菌唑、氟啶胺在中、高质量浓度下，对离体葡萄绿枝条和盆栽葡萄幼苗新梢具有较好的保护作用，防治效果在57.81%～77.56%之间，可作为推荐药剂进一步在田间进行药效的验证。

戊唑醇属于三唑类杀菌剂，可通过杂环上的氮原子与甾醇上的14α脱甲基酶P450的血红素铁活性中心形成配位键，抑制由CytP450加单氧酶催化的脱甲基反应，从而破坏麦角甾醇的合成，造成细胞膜的功能异常和结构损伤［1719］，使细胞非正常死亡。国内学者报道三唑类杀菌剂中的苯醚甲环唑、丙环唑对可可毛色二孢的菌丝生长均具有明显的抑制作用［8， 2021］，Gramaje等认为三唑类药剂强烈抑制多种葡萄枝干病害病原菌的菌丝生长，部分药剂的活性在植株上也进行了验证［22］，Di等发现环唑醇、三环醇对早期出现葡萄枝干病害症状的幼嫩葡萄树有一定的治疗效果［23］，但因大多数三唑类药剂的作用位点单一，已报道葡萄白粉病菌［24］和葡萄炭疽病菌［25］对戊唑醇产生了抗性，为了避免或延缓抗药性的发展，需要研发替代药剂以构建葡萄溃疡病综合治理技术。

氯氟醚菌唑是巴斯夫公司研发、上市的新型异丙醇三唑类杀菌剂，其分子中独特的异丙醇基团，使其可以灵活地从游离态自由旋转与靶标结合成为结合态，从而减少病菌突变、延缓抗药性的产生［26］。另外，它具有优异的桶混性能，能够与琥珀酸脱氢酶类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（如吡唑醚菌酯）等复配，能进一步延缓杀菌剂抗药性的产生和发展，是有力的病害防治和抗药性治理工具［27］。研究表明，相对于传统的三唑类杀菌剂，氯氟醚菌唑具有更高的选择性和内吸传导性［28］，对于小麦锈病、玉米大斑病、小麦白粉病、大麦叶枯病、黄瓜炭疽病、花生褐斑病［29］等都具有优异的防治效果，本研究中氯氟醚菌唑对可可毛色二孢的菌丝生长和孢子萌发均具有很好的抑制效果，通过离体和活体接种试验证实该杀菌剂在葡萄溃疡病防治中具有良好的保护效果，应用潜力较大。

氟啶胺最早由日本石原产业株式会社登记上市，属于二硝基苯胺类杀菌剂，是线粒体氧化磷酰化解偶联剂，对于马铃薯晚疫病、蔬菜根肿病等具有良好的防治效果［30］，国外多位学者发现氟啶胺对葡萄溃疡病菌和葡萄顶枯病菌 Eutypa lata的孢子萌发具有很强的抑制作用，进一步证实在葡萄修剪时氟啶胺作为伤口保护药剂，对葡萄溃疡病具有较好的防治效果［3132］，本研究也同样发现氟啶胺对可可毛色二孢菌丝生长和孢子萌发具有很好的抑制效果，喷施离体葡萄枝条和盆栽葡萄幼苗，对于可可毛色二孢引起的葡萄溃疡病具有较好的预防效果，在病原菌侵染前或发病初期使用可以有效控制葡萄溃疡病的发生和蔓延，是延缓苯并咪唑类、三唑类杀菌剂过量频繁使用带来的抗药性问题的有效措施。

近年来，葡萄溃疡病的危害及防治越来越受到全球学者的关注，但受制于病原菌种类多样性以及葡萄种植区域广泛性等因素，国内外缺乏高效的防控技术。葡萄溃疡病的病原菌主要在修剪掉的枝干中越冬，修剪口处是病原菌主要的侵入部位，在修剪口处喷施杀菌剂可在一定时间内避免病原菌的侵入［33］。本研究筛选出戊唑醇、氯氟醚菌唑和氟啶胺室内生物活性较高，进一步的接种试验显示3种杀菌剂保护作用较好，可在田间喷施修剪口以减少病原菌侵染。但杀菌剂对裸露伤口部位的保护一般在4～26周［34］，而伤口可能一直处在对病原菌较为敏感的状态，因此需要与其他能够提高葡萄自身抗病性的措施，比如生防菌剂、免疫诱抗剂的协调使用来建立绿色高效的葡萄溃疡病综合防治技术。

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