一款含透皮纤连蛋白面霜的修护、舒缓功效研究

王伟杰 赵敏 华振

【摘 要】目的 制備一款针对受损肌肤的面霜，并对其修护、舒缓功效进行探究。方法 配置5 mg/ml透皮纤连蛋白溶液，使用乳猪皮通过体外渗透试验进行透皮纤连蛋白渗透测试，将皮肤模型随机分为BC组、NC组、PC组和样品组，给予各组胶原纤维染色和HE染色，进行脂质含量分析，并基于人体的面部图像观察。结果 透皮纤连蛋白的荧光积分光密度（IOD）分析显示，在渗透24 h后，透皮纤连蛋白在组织中的渗透量显著高于量高于纤连蛋白（P<0.01）；在渗透2、6、24 h后，透皮纤连蛋白在接收液中的渗透量均显著高于纤连蛋白（P<0.01）；PC组、样品组的积分光密度值均显著高于NC组（P<0.01）；丝聚蛋白（FLG）免疫荧光结果显示，和BC组相比，NC组的荧光信号减弱，FLG含量显著下降（P<0.01）；与NC组相比，PC组和样品组的FLG荧光信号显著增加，FLG含量显著上升（P<0.01）；与NC组相比，PC组与样品组的荧光信号显著增强（P<0.01）；和BC组相比，PC组和样品组胆固醇含量、脂肪酸均含量、神经酰胺的含量均显著增加（P<0.01），且透皮纤连蛋白组的组织形态、患者脸部红区均有明显改善。结论 透皮纤连蛋白的渗透显著性优于普通纤连蛋白，可有效改善真皮皮肤模型胶原纤维的损伤，促进真皮修复；纤连蛋白面霜能有效改善SLS刺激的3D表皮皮肤模型EpiKutis的组织形态，显著提升丝聚蛋白（FLG）、屏障脂质含量（胆固醇、神经酰胺、脂肪酸），改善面部皮肤红区，具有良好的修护及舒缓功效。

【关键词】透皮纤连蛋白；修护；舒缓；功效评价；3D皮肤模型

中图分类号：TQ658.2 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2023）08-0090-05

Study on the Repair and Soothing Effect of a Transdermal Fibronectin-containing Facial Cream

WANG Wei-jie1， ZHAO Min2， HUA Zhen3

（1.Guangzhou Yisheng Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangdong Boxi Biotechnology Co.， Ltd.， Xi’an 710000， Shaanxi， China； 3.The Second Affiliated Hospital of Air Force Military Medical University， Xi’an 710000， Shaanxi， China）

【Abstract】Objective To prepare a cream for damaged skin， and to explore its repair and soothing effect. Methods A 5 mg/ml transdermal fibronectin solution was prepared， and the transdermal fibronectin penetration test was performed using suckling pig skin through in vitro penetration test. The skin model was randomly divided into BC group， NC group， PC group and sample group. Collagen fiber staining and HE staining were performed in each group for lipid content analysis and observation based on human facial images. Results Fluorescence integral optical density （IOD） analysis of transdermal fibronectin showed that after 24 h of penetration， the penetration of transdermal fibronectin in tissues was significantly higher than that of fibronectin （P<0.01）. After 2， 6 and 24 h of permeation， the permeation amount of transdermal fibronectin in the receiving solution was significantly higher than that of fibronectin（P<0.01）. The integral optical density values of PC group and sample group were significantly higher than those of NC group （P<0.01）. The results of FLG immunofluorescence showed that compared with BC group， the fluorescence signal of NC group was weakened， and the content of FLG was significantly decreased （P<0.01）. Compared with the NC group， the FLG fluorescence signal of the PC group and the sample group increased significantly， and the FLG content increased significantly （P<0.01）. Compared with NC group， the fluorescence signal of PC group and sample group was significantly enhanced （P<0.01）. Compared with the BC group， the cholesterol content， fatty acid content and ceramide content in the PC group and the sample group were significantly increased（P<0.01）， and the tissue morphology of the transdermal fibronectin group and the red area of the patient’s face were significantly improved. Conclusion The permeability of transdermal fibronectin is significantly better than that of ordinary fibronectin， which can effectively improve the damage of collagen fibers in dermal skin model and promote dermal repair. Fibronectin facial cream can effectively improve the tissue morphology of EpiKutis？， a 3D epidermal skin model stimulated by SLS， significantly increase the content of silk polyprotein （FLG） and barrier lipids （cholesterol， ceramide， fatty acid）， and improve the red area of facial skin.

【Key words】Transdermal fibronectin； Repair； Soothing； Efficacy evaluation； 3D skin model

纤连蛋白（fibronectin，Fn）是一种普遍存在的细胞外基质（ECM）蛋白，参与了许多重要的细胞过程，包括伤口愈合和胚胎发育，以及细胞粘附和迁移等行为的调节。有研究表明[1]，纤连蛋白参与了伤口愈合的所有阶段并在伤口愈合过程中表达上调。随着对纤连蛋白创伤修复分子机制的深入研究，其在新兴生物领域的应用也愈加广泛，并逐步应用于美容护肤领域。体外研究表明[2]，纤连蛋白具有促进细胞增殖、创面愈合、胶原合成等作用，因此纤连蛋白是促进医美术后修复的理想活性物质。然而，纤连蛋白作为一种二聚体黏附糖蛋白，由2个约250 kDa的亚基组成的大分子，很难经皮渗透进入活细胞层发挥其生物活性[3，4]。透皮纤连蛋白是利用重组DNA技术，截取天然纤连蛋白核心活性区域，融入生物透皮肽技术，经重新组合形成的高活性、高渗透性的小分子化纤连蛋白，在保留生物活性的同时提高其经皮吸收率。透皮纤连蛋白面霜是基于前期的基础研究所开发出来的，透皮纤连蛋白含量为0.25%[5，6]。本研究通过体外渗透实验评价透皮纤连蛋白的渗透性，通过SLS刺激的3D表皮皮肤模型、UVA辐射刺激的真皮皮肤模型和人体试验检测组织形态、丝聚蛋白、脂质、胶原纤维变化情况，观察志愿者面部红斑改善情况，探讨该面霜的修护、舒缓功效。

1.1 试剂与仪器 试剂：透皮纤连蛋白（广州壹笙科技有限公司）；纤连蛋白（广州壹笙科技有限公司），荧光标记的透皮纤连蛋白（广东博溪生物）；荧光标记的纤连蛋白（广东博溪生物科技有限公司）；透皮纤连蛋白面霜（广州壹笙科技有限公司，透皮纤连蛋白量含为0.25%）等。模型：3D表皮皮肤模型（广东博溪生物科技有限公司，EpiKutis？，ES221105）；真皮皮肤模型（广东博溪生物科技有限公司，DermiKutis？，F221104）等。

1.2 實验方法

1.2.1样品配制 5 mg/ml透皮纤连蛋白溶液：称取适量透皮纤连蛋白粉末，稀释成25 mg/ml浓度，过滤后加入真皮皮肤模型中，最终浓度为5 mg/ml。0.25%荧光标记的纤连蛋白：称取12.5 mg荧光标记后的纤连蛋白溶于5 ml的PBS中，混匀。

1.2.2体外渗透实验 将猪皮固定供给室和接收室之间；向接收室中加入接收液7.0 ml，猪皮固定后，添加1 ml接收液（PBS），排净空气；向供给室中皮肤表面加入样品，有效渗透面积S约为3.14 cm2。将透皮纤连蛋白样品添加至猪皮表面，均匀涂开。分别于渗透后2、6、24 h时间点采集皮肤样本，吸取PBS清洗皮肤表面5次，用棉签将表面残留液体擦干，用刀片环切皮肤，浸于4%多聚甲醛溶液中固定（固定时间≥24 h）。

1.2.3胶原纤维染色 将真皮皮肤模型（DermiKutis）移到6孔板上，每孔加入2 ml的皮肤模型培养液。同时将模型随机分为BC组、NC组、PC组和样品组，每组3个重复。除BC组外，NC组、PC组和样品组分别进行UVA辐照（30 J/cm2），隔天辐照，辐照3次。辐照后给药，PC组液下给药阳性对照物使终浓度为VC 100μg/ml+VE 7 μg/ml、样品组液下给药纤连蛋白溶液使终浓度为5 mg/ml。

1.2.4 HE染色、FLG免疫荧光、脂质尼罗红染色①3D表皮模型给药：将表3D皮模型转移到6孔板中（提前添加0.9 ml EpiGrowth培养液），NC组、PC组和样品组表面添加25 μl 0.1%的SLS溶液，孵育30 min。PC组液下给药12.5 μl 50 μM WY14643[7]，样品组添加12.5 μl纤连蛋白面霜，置于CO2培养箱（37 ℃、5%CO2）中孵育24 h；②HE染色：将模型环切取下，用4%的多聚甲醛进行固定处理，取样品切片进行H&E染色检测；③FLG免疫荧光检测：用4%的多聚甲醛进行固定24 h后切片，进行免疫荧光检测（按试剂盒说明书操作）；④脂质尼罗红染色：加50 μl尼罗红染色液在组织切片上，室温，避光染色20 min后，用蒸馏水冲洗切片。

1.2.5 脂质含量分析 ①模型给药：将模型转移到6孔板中（提前添加0.9 ml EpiGrowth培养液），将模型随机分为BC组、PC组、样品组；PC组添加相应浓度的WY14643工作液，样品组以相应的样品进行处理；②胆固醇测试：将模型环切至1.5 ml离心管中，加入500 μl 0.2 mg/ml蛋白酶K，置于50 ℃水浴1 h；待角质层脱落后，每管加入250 μl的甲醇，超声30 min，然后14000 rpm离心10 min、60 ℃蒸干甲醇后，保存于4 ℃；③神经酰胺、脂肪酸提取及检测：将模型置于离心管中，加入蛋白酶K溶液，50 ℃水浴2 h；水浴结束后用镊子夹取角质层于去离子水中漂洗，并置于新的离心管中。

1.2.6基于人体的面部图像观察 招募6名成年志愿者试用透皮纤连蛋白面霜，早晚各使用1次，0.5 g/次。在产品使用2周和4周后，6位受试者进行现场回访，用Visia 7.0仪器拍照观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0统计学软件进行分析，计量资料以（x-±s）表示，行t检验；以P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著，P<0.001表示统计学意义极显著。

2.1 透皮纤连蛋白的渗透测试 体外渗透实验荧光显微镜观察结果显示，0.25%纤连蛋白和0.25%透皮纤连蛋白冻干粉作用于乳猪皮2、6、24 h后均发生了渗透行为，且随着时间的增加，皮肤组织中渗透量不断增加。荧光积分光密度（IOD）分析显示，渗透2、6 h后，透皮纤连蛋白在组织中的渗透量高于纤连蛋白，但差异无统计学意义（P>0.05）；渗透24 h后，透皮纤连蛋白在组织中的渗透量显著高于量高于纤连蛋白（P<0.01）（图1），表明渗透24 h后，0.25%透皮纤连蛋白冻干粉的渗透性显著优于0.25%纤连蛋白。通过比较接收液荧光OD值结果发现，作用2、6、24 h后，透皮纤连蛋白在接收液中的渗透量均显著高于纤连蛋白（P<0.01）（图2），表明0.25%透皮纤连蛋白冻干粉的渗透性优于0.25%纤连蛋白。活性成分只有渗透进活细胞层才能发挥其生物活性，活性物的渗透性是活性物发挥生物活性的基础，预示着同浓度的透皮纤连蛋白可能比纤连蛋白表现出更有效的生物活性。

2.2 透皮纤连蛋白的修护功效

2.2.1胶原纤维Masson染色 Masson染色是显示胶原纤维分布的经典染色方法，利用染色的两种不同分子量的阴离子在组织渗透性的差异，根据不同的渗透性能差异，区分出不同的组织成分。和BC组相比，在UVA刺激下NC组的胶原纤维损伤明显出现胶原纤维减少断裂的现象[8]。对染色结果进行观察，PC组和样品组与NC组相比，胶原纤维的数量增加断裂减少；对各组的积分光密度（IOD）进行统计学分析，PC组、样品组的积分光密度值均显著高于NC组（P<0.01）（图3），表明在VC 100 μg/ml+VE 7μg/ml和透皮纤连蛋白5 mg/ml的作用下能显著改善UVA刺激引起的真皮皮肤模型胶原纤维损伤。

2.2.2 FLG含量测试 FLG是角化包膜组装过程中关键的成分，是颗粒层向角质层分化的重要标志物，FLG的表达有利于促进皮肤屏障的正常分化。FLG除了是皮肤屏障的结构性组成，还能够在半胱胺酸蛋白酶蛋白14（Caspase-14）水解形成天然保湿因子，因此也起到了保湿的作用[9]。FLG免疫荧光结果显示，和BC组相比，NC组的荧光信号减弱，表示SLS刺激对模型产生损伤，积分光密度提示FLG含量显著下降（P<0.01）；与NC组相比，PC组和样品组的FLG荧光信号显著增加，积分光密度结果提示FLG含量显著上升（P<0.01）（圖4），表明在阳性对照物50μM WY14643和0.25%透皮纤连蛋白面霜作用下能通过显著提升FLG蛋白含量改善SLS刺激引起的3D表皮模型屏障损伤。

2.2.3 脂质的尼罗红染色 尼罗红是一种亲脂性的恶嗪类荧光染料，可与脂类物质结合，在激发波长530 nm激发下，显示强烈桔红色荧光[10]。本次实验的4个组都显示橘红色荧光，说明4个组的模型都存在脂质，积分光密度（IOD）结果显示，BC组的荧光最强，表明BC组的表皮模型的脂质含量最高；NC组的荧光信号最弱，表明NC组的脂质含量最低。与NC组相比，PC组与样品组的荧光信号更强，差异有显著意义（P<0.01）（图5），表明50μM WY14643和0.25%透皮纤连蛋白面霜均能显著改善SLS刺激表皮模型的脂质含量。

2.2.4 脂质含量分析 结构性脂质是角质层砖灰结构中的“砂浆”，对屏障结构的稳定性，皮肤的选择性渗透，保持皮肤水分至关重要，结构性脂质主要包含胆固醇、脂肪酸、神经酰胺，三者分布于角质细胞之间，是皮肤保持正常屏障功能不可缺少的结构性成分[11]，其中神经酰胺占比约为50%，是结构性脂质最重要的成分之一[12]。因此本次实验研究了0.25%透皮纤连蛋白面霜对3D表皮模型胆固醇、脂肪酸、神经酰胺含量的影响。结果显示，和BC组相比，PC组和样品组胆固醇含量、脂肪酸总浓度、神经酰胺总浓度均显著增加（P<0.01）（图6）。阳性对照物作用后虽然神经酰胺含量有所增加，但由于SD值较大而没有统计学差异；脂质含量分析结果表明，样品面霜能通过上调胆固醇、脂肪酸、神经酰胺含量提升屏障功能[13]。

2.2.5 组织形态 在×40镜下观察组织形态发现，与BC组相比，SLS刺激后NC组表皮模型活细胞层变薄，而且出现空泡现象；与NC组相比，PC组和样品组模型活细胞层增厚，细胞损伤明显改善，表明阳性对照物和0.25%透皮纤连蛋白面霜能有效改善SLS刺激引起的表皮模型损伤。

2.2.6 基于人体的面部图像观察 6名拍照志愿者的面部图像显示，使用0.25%透皮纤连蛋白面霜4周后面部的红区变小，用Visia拍摄志愿者使用前后的面部照片，使用后志愿者的面部红区减少，颜色变浅（图7），提示0.25%透皮纤连蛋白面霜具有修护、舒缓功效。

通过渗透实验、体外修护功效评价实验、人体试验发现透皮纤连蛋白的渗透显著性优于普通纤连蛋白，透皮纤连蛋白可有效改善UVB诱导的真皮胶原纤维损伤，促进真皮结构修复。纤连蛋白面霜能有效改善SLS刺激的3D表皮皮肤模型EpiKutis？的组织形态，通过显著提升丝聚蛋白（FLG）、胆固醇、神经酰胺、脂肪酸含量，增强皮肤屏障结构，改善面部皮肤红区，发挥皮肤修护、舒缓的功效，可用于有面部修护、舒缓需求的人群。电子注射（水光疗法）、光声电治疗通过对表皮或真皮造成不同程度的损伤而发挥美容作用，本次研究表明透皮纤连蛋白面霜能有效渗透至皮下，促进组织修复，对促进行电子注射（水光疗法）、光声电治疗的术后恢复具有积极意义。

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编辑 扶田