低交联透明质酸与再生材料联合应用的相容性评估

费松 吴伟东 王瑛 古佳升 桃卓嫣 方明星 李丹

【摘 要】目的 評估小分子透明质酸与β-葡聚糖、聚乳酸、羟基磷灰石联合应用的组织相容性。方法Wistar大鼠18只随机分为3期实验各6只，于背部划分4个部位，根据注射不同配方的试剂分为4组。对照组注射小分子透明质酸1.00 ml，葡聚糖组注射0.25 ml小分子透明质酸+0.75 mlβ-葡聚糖，聚乳酸组注射0.25 ml小分子透明质酸+0.75 ml聚乳酸，羟基磷灰石组注射0.25 ml小分子透明质酸+0.75 ml羟基磷灰石，分别于注射7、14、28 d后处死大鼠，取其注射部位组织制成切片，经HE染色后观察免疫反应，免疫印迹法检测第三期实验大鼠皮肤组织中白介素1的表达水平。结果 7 d实验中聚乳酸及羟基磷灰石组表现出轻微的免疫反应，14 d实验中各组的免疫反应均呈上升趋势，28 d实验中各组的免疫反应均消退；免疫印迹法结果显示，28 d实验中三组注射部位的IL-1均低表达，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 小分子透明质酸与β-葡聚糖、聚乳酸、羟基磷灰石的联合应用具有较好的组织相容性。

【关键词】透明质酸；β-葡聚糖；聚乳酸；羟基磷灰石

中图分类号：R318.08 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2023）08-0095-04

Compatibility Evaluation of Low Cross-linked Hyaluronic Acid Combined with Recycled Materials

FEI Song1， WU Wei-dong 1， WANG Ying2， GU Jia-sheng1， TAO Zhuo-yan1， FANG Ming-xing1， LI Dan1

（1.Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital of Jinan University， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangzhou Xiao Man Yao Medical Equipment Co.， Ltd.， Guangzhou 510000， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To evaluate the histocompatibility of small molecular hyaluronic acid combined with β-glucan， polylactic acid and hydroxyapatite. Methods Eighteen Wistar rats were randomly divided into three phases of experiments， with 6 rats in each phase. Four parts were divided on the back and divided into 4 groups according to different formulations of reagents. The control group was injected with 1.00 ml of small molecular hyaluronic acid， the dextran group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of β-glucan， the polylactic acid group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of polylactic acid， and the hydroxyapatite group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of hydroxyapatite. The rats were sacrificed after 7， 14 and 28 days of injection， and the tissues at the injection site were taken and made into sections. The immune response was observed after HE staining， and the expression level of interleukin 1 in the skin tissue of the third phase of the experimental rats was detected by Western blotting. Results In the 7 d experiment， the polylactic acid and hydroxyapatite groups showed a slight immune response. In the 14 d experiment， the immune response of each group showed an upward trend， and the immune response of each group subsided in the 28 d experiment. The results of immunoblotting showed that the expression of IL-1 in the injection site of the three groups was low in the 28 d experiment， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion The combination of small-molecule hyaluronic acid with β-glucan， polylactic acid and hydroxyapatite has good histocompatibility.

【Key words】Hyaluronic acid； β-glucan； Polylactic acid； Hydroxyapatite

皮肤的弹性和水分会随着年龄的增长或受周围环境的影响引起水分和胶原的流失[1]，为解决这一问题，医学上多采用皮下注射填充物来保障水分的保持或促进组织胶原的生成。目前医学上使用较多的皮下填充产品有透明质酸、β-葡聚糖、聚乳酸、羟基磷灰石钙等。各种材料都有其特点，也有不足之处，材料与材料间的联合应用或联合微针等方式可获得更好的治疗效果。透明质酸已经广泛用于皮肤美容[2]，通过与其他材料联合应用或聯合其他疗法，可提高疗效[3]，同时也可能引起一系列的不良反应，如血管栓塞、感染、组织坏死等。因此，为评价不同皮下填充材料的生物安全性，本实验将以小分子透明质酸为对照组，小分子透明质酸联合β-葡聚糖、聚乳酸、羟基磷灰石等已经在市面上广泛使用的填充材料为实验组，于大鼠皮下注射，观察不良反应和微观下免疫反应，通过各组注射材料的结果互相比较，以评估联合应用材料的安全性。

1.1 实验动物 SPF级 Wistar 大鼠18只（购自南方医科大学实验动物管理中心），周龄6周，体重（200±20）g，动物实验按照《国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行，伦理号HTSW211103。大鼠饲养环境：室温（25±2）℃，相对湿度（50±5）%，12 h明暗交替，分笼饲养，自由摄食饮水，饲养7 d。

1.2 试剂与仪器 小分子透明质酸（广州小蛮腰医疗器械有限公司）；β-葡聚糖（广州小蛮腰医疗器械有限公司）；聚乳酸；羟基磷灰石；白介素1（IL-1）和GADPH兔一抗抗体（博奥森），IL-1和GADPH羊抗兔二抗抗体（博奥森）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；二甲苯（天津市富宇精细化工有限公司）；伊红染液、苏木素染液、中性树胶（谷歌生物科技有限公司）；显微镜（上海通灏光电科技有限公司）；摊烤片机（湖北安立信医疗实业有限公司）；脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）。

1.3 实验分组 18只大鼠编号后采用随机数字表法分为3期实验，每期各6只，分别为7 d一期实验、 14 d二期实验和28 d三期实验，大鼠背部各选取4个注射点，注射间隔1 cm以上，注射剂量均为1 ml，根据注射材料不同分为4组。对照组注射小分子透明质酸1 ml；葡聚糖组注射小分子透明质酸0.25 ml+β-葡聚糖0.75 ml；聚乳酸组注射小分子透明质酸0.25 ml+聚乳酸0.75 ml；羟基磷灰石组注射小分子透明质酸0.25 ml+羟基磷灰石0.75 ml。

1.4 实验方法 18只大鼠禁食12 h、禁水4 h后，称重，采用7%水合氯醛（剂量：0.03 ml/kg）进行腹腔注射麻醉。麻醉成功后对大鼠背部皮肤进行备皮，选取脊柱旁两侧约2 cm 皮下组织为注射中心点，以注射点中心划分1.5 cm宽度的正方形区域使用记号笔标注，一只大鼠背部脊柱两侧分别标注4个区域。经75%医用酒精擦拭皮肤表面消毒；利用30 G注射针头斜面向上刺入表皮至皮下组织层，回抽无回血后进行注射，每个部位注射对应的剂量为1 ml，射后予以轻度按摩使材料分布更均匀。注射完成后常规饲养规饲养，于7、14、28 d后，分别采用脊髓脱臼法处死对应实验组的大鼠，去除大鼠背部毛发，对标记笔标注的注射区域用手术刀切开皮肤全层，拍照记录，使用蚊式钳钝性分离剩余的注射材料及周围组织，保持包膜完整。

1.4.1苏木精-伊红染色法 用组织剪剪取残余的皮下组织，于10%甲醛溶液中固定48 h。流水缓慢冲洗4～8 h以洗去甲醛；将包埋块装在一个网兜里，放入70%乙醇过夜。第2天，依次放入80%、90%、100% A、100% B乙醇浸泡各1 h，二甲苯A、二甲苯B各浸泡30 min，至组织块呈现棕黄色或暗红色透明状，放入水浴机石蜡缸A、B、C各1.5 h（60 ℃），包埋块和包埋模具放入包埋仪至少30 min，包埋后关闭水浴箱，使用莱卡切片机切片，厚度为4 μm，45 ℃摊片，烤片机75 ℃烤片60 min。将石蜡切片放入染色盒，用二甲苯A、B、C各脱蜡5 min。依次100%、95%、80%、70%的酒精，入蒸馏水2次，5 min/次。苏木素染核1 min，流水冲洗干净，0.1%盐酸酒精分化10 s，入蒸馏水放置10 min。0.5%伊红染色1 min，流水冲洗干净，入蒸馏水3 min，取出玻片放在通风橱里晾干。用中性树胶对晾干的组织切片进行封片。在光学显微镜下找到目标部位，拍照。

1.4.2免疫印迹法 将用组织剪剪取皮下组织后提取组织总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量后将蛋白样品调至等浓度，SDS-PAGE电泳，转膜后，4 ℃冰箱孵育IL-1和GADPH-抗过夜，与相应二抗室温下孵育2 h，ECL显影，拍照，进行图像分析。以Image J 软件分析蛋白条带得到的灰度值表示IL-1蛋白的相对表达水平，以GADPH为内参，实验重复 3 次以上，取平均值。

1.5 组织学评价 皮肤对材料的免疫反应的程度按照2015国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心，医疗器械生物学评价第6部分：植入后局部反应试验半定量评分系统中的生物学反应评价标准，根据细胞类型/反应、新血管生成、纤维化、脂肪浸润等情况进行评价，实验组评分减去对照组的评分，得到的差值作为判断材料对组织的刺激等级，具体判定标准为：无刺激：0～2.9分；轻度刺激：3.0～8.9分；中度刺激：9.0～15.0分；重度刺激：>15.0分。

1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x-±s）表示，多组间比较行F检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

术后大鼠进食，活动均正常，术后背部局部无明显肿胀，所有实验动物均存活。

2.1 皮肤组织大体观 皮肤外可见注射材料所在部位有轻微凸起，无明显红肿、坏死、化脓。皮下解剖可见清晰的血管形状，注射材料所在部位的周围组织与其他部位组织无明显改变，无血管栓塞、组织坏死等表现，见图1。

2.2 生物反应评价 每期实验6只大鼠相同材料部位的评分取平均值，刺激平均評分=实验组平均评分-对照组平均评分，结果见表2。7 d实验中，各组刺激性分级情况均低；14 d实验中，与对照组相比，葡聚糖组、聚乳酸组及羟基磷灰石组刺激分级均表现出一定的刺激性；28 d实验中，各组的刺激性分级情况均偏低，且呈下降趋势，见表1。

2.3 术后三期实验各组材料注射部位宿主反应 7 d实验中，对照组仅有少量炎细胞浸润；葡聚糖组除少量炎细胞外，还有一些纤维形成；聚乳酸组出现大量的炎细胞，纤维囊壁形成广泛且排列紊乱，羟基磷灰石中的炎细胞程度轻微，可见少许血管。14 d实验中，对照组的炎细胞较前减轻，且开始出现纤维层；葡聚糖组的炎细胞继续增加，且纤维层较前明显增多增厚，排列整齐，出现少许新生血管；聚乳酸组的炎细胞更为明显，且纤维层较前整齐，出现大量的新生血管；羟基磷灰石的炎细胞反应较前减退，且纤维较前增厚，且紊乱。28 d实验中，对照组的纤维层继续增厚增多，炎细胞没有继续上升的趋势；葡聚糖组的炎性反应明显下降，且纤维层继续增多增粗，排列整齐；此外，可见大量小血管生成；聚乳酸组炎细胞较前轻微，纤维层继续增粗但排列紊乱，未见14 d时丰富的新生小血管；羟基磷灰石组几乎不可见血管生成，炎细胞消退，纤维层较对照组明显薄弱。HE染色实验切片见图2。

2.4 IL-1的表达水平 免疫印迹法结果显示，28 d实验中三组注射部位的IL-1均呈低表达，差异无统计学意义（P>0.05，F=2.101），见图3。

透明质酸是一种细胞外基质的天然糖胺聚糖，具有良好的保湿功能，能够改善皮肤干燥粗糙、毛孔粗大等问题[4]。β-葡聚糖是一种以糖苷键连接的同型多糖，不仅能作为血浆替代物，还能增强免疫细胞活性，促进伤口愈合，同时可延缓皮肤老化，是一种良好的皮肤填充材料。聚乳酸是从可再生植物中提取发酵而来的聚合物，对人体无毒无害，且生物相容性良好，可降解，作为一种医学高分子材料，常用于组织修复。

本次三期实验中发现，所有实验组均表现出一定的炎细胞及组织反应，但在28 d时均逐渐消退，各组均未表现出明显的纤维化、组织紊乱、坏死，注射材料引起的免疫反应最后都基本消退，表现出良好的组织相容性。在生物反应性评价平均评分上看，葡聚糖组及聚乳酸组的评分在后两期实验中，特别是第二期的表现是要稍微高于其他两组的，造成这种现象的原因主要是β-葡聚糖由于被免疫活性细胞膜上的受体识别，激活了包括巨噬细胞在内的免疫细胞等，促进细胞释放白介素，因此白介素的表达水平较高。而聚乳酸在代谢过程中产生乳酸，刺激成纤维母细胞的增殖和胶原蛋白再生，在这个过程中产生了一定的免疫反应。透明质酸会在透明质酸酶及透明质酸降解蛋白（HYAL1和HYAL2）的参与下被降解，但这个过程并不会引起明显的组织反应。透明质酸注射后能刺激转化生长因子，结缔组织生长因子等细胞因子的产生，促进胶原等细胞外基质的合成，表现出一定的纤维增生。β-葡聚糖在7、14 d实验中引起免疫反应，一方面激活成纤维细胞，不断分泌前胶原蛋白，并形成胶原纤维，另一方面使组织中的巨噬细胞数量增加，巨噬细胞促进组织成EGFR表皮生长因子和VEGF血管生成因子的分泌，两者共同作用于内皮细胞，促进新生血管的形成。同时，28 d实验中三组注射部位的IL-1均呈低表达，差异无统计学意义（P>0.05），证实了透明质酸联合其他材料注射的安全性良好。

综上所述，小分子透明质酸与β-葡聚糖、聚乳酸、羟基磷灰石的联合应用具有较好的组织相容性。

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编辑 扶田