男性烟依赖者CDH23基因甲基化与颈动脉粥样硬化关系

彭琳,谭巧文,韩莹,赵静怡,郭宗君

(1 青岛大学附属医院老年医学科,山东 青岛 266100; 2 青岛滨海学院附属医院消化内科)

调查显示,中国吸烟人群数量仍较多[1]。烟依赖是慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、动脉粥样硬化的独立危险因素[2]。CDH23基因编码的钙黏附素23,是钙黏附素超家族中的典型成员,介导钙离子依赖的细胞间和细胞内黏附[3]。一项对中国烟依赖人群的全基因组检测结果显示,烟依赖人群细胞黏附分子(钙黏附素23)与烟依赖相关[4]。DNA甲基化是基因组的表观遗传修饰,参与调控基因表达和基因组稳定性[5]。尼古丁是导致动脉粥样硬化的独立危险因素[6]。烟依赖者是否存在CDH23基因位点甲基化变化,这种改变是否与烟依赖者颈动脉粥样硬化发生相关,目前尚无相关文献报道。本文从临床角度验证烟依赖是否会导致CDH23基因位点甲基化状态改变,并进一步探究这种甲基化状态改变是否与颈动脉粥样硬化的发生相关。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取青岛某三甲医院健康查体的男性130例作为研究对象,有烟依赖史者64例纳入烟依赖组,无烟依赖史者66例纳入对照组。所有研究对象纳入标准:①男性,居住地长期住户且年龄≥45岁;②烟依赖者与对照者之间排除血缘关系;③过去1年间无除尼古丁以外的滥用物质史;④获得知情同意。烟依赖组入组标准:①符合美国精神障碍诊断统计手册第四版(DSM-IV)关于物质依赖的诊断标准;②在过去1年内每天吸烟≥10支,吸烟≥2年或戒烟<3个月[7]。对照组入组标准:①无烟依赖史或者明显被动烟依赖史,在入组前总计吸烟量<5支;②无定期使用任何尼古丁替代品(例如尼古丁贴片、尼古丁口香糖等)或其他烟草制品(如电子烟、雪茄等)[8]。排除标准:①有除尼古丁以外的滥用物质史(如药物、乙醇等);②有某种精神疾病(如抑郁、精神分裂症等)或病史;③严重心脑疾病等多脏器功能障碍或无法配合临床量表调查者。本研究得到青岛大学附属医院伦理委员会批准,所有研究对象或其家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1一般资料收集 由经过专业培训的老年医学科医师,采用问卷调查方式收集研究对象一般资料,包括年龄、受教育年限、烟依赖史(初始吸烟年龄、每日吸烟数量、吸烟持续时间、戒烟时间等)、既往疾病史;应用尼古丁依赖量表(FTND)[9]评估烟依赖者对烟草的依赖程度。既往疾病史包括高血压、糖尿病、高脂血症等疾病史,其诊断根据相关文献的标准[10-12]。

1.2.2颈部血管超声检查 应用GE LOGIQ E9型彩色多普勒超声检查设备,由同一人进行颈动脉超声检查,记录研究对象颈动脉内膜厚度。根据2009年《血管超声检查指南》[13]标准,颈动脉内-中膜厚度(IMT)<1.0 mm 为正常,IMT≥1.0 mm为内-中膜增厚。

1.2.3CDH23基因甲基化检测 采集受试对象空腹外周静脉血5 mL,放入EDTA抗凝管中,再提取管中血样1 mL放入EP管中,-80 ℃冰箱保存。CDH23基因甲基化检测由上海天昊生物科技有限公司完成,检测流程:①样品质控;②引物设计与单位点PCR条件优化;③多重PCR引物panel优化;④重亚硫酸盐处理;⑤样本目标片段多重PCR反应;⑥样本添加特异性标签序列;⑦定量后上机测序,最终于Illumina Hiseq平台上,以2×150 bp的双端测序模式进行高通量测序,获得基因位点甲基化原始数据。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组一般资料比较

两组间平均年龄、受教育年限比较,差异均无统计学意义(P>0.05);两组间高血压史、糖尿病史、高脂血症史比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。烟依赖组初始吸烟年龄(24.06±7.48)岁,持续时间(31.45±9.36)年,每日吸烟量(20.73±9.92)支,FTND评分(6.38±1.30)分。

表1 两组基线资料比较

2.2 两组CDH23基因甲基化位点差异比较

CDH23基因启动子存在4个完整的CpG岛,分别为CDH23-1、CDH23-2、CDH23-3、CDH23-4,其中CDH23-1包含24个CpG位点,CDH23-2包含17个CpG位点,CDH23-3包含12个CpG位点,CDH23-4包含13个CpG位点。检测两组共计66个位点甲基化值,结果显示烟依赖组CDH23-1片段中的CpG246位点、CDH23-2片段中的CpG48位点甲基化水平低于对照组,差异有统计学意义(t=-2.454、-2.436,P<0.05)。见表2。烟依赖组CDH23-1片段中的CpG110、CpG112、CpG127、CpG131、CpG135、CpG139、CpG147、CpG156、CpG162、CpG170、CpG191、CpG195、CpG200、CpG222、CpG224位点,CDH23-2片段的CpG36、CpG38、CpG43、CpG57、CpG60、CpG62、CpG64、CpG88、CpG101、CpG140、CpG152、CpG185位点,CDH23-3片段中的CpG50、CpG52、CpG62、CpG80、CpG91、CpG98位点,CDH23-4片段中的CpG33、CpG55、CpG89、CpG138、CpG166、CpG192、CpG208等40个位点甲基化程度均低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 两组CDH23基因甲基化水平差异比较

2.3 两组CDH23基因片段甲基化程度差异比较

以CDH23-1、CDH23-2、CDH23-3、CDH23-4所包含的位点的平均甲基化程度作为该片段的平均甲基化程度,烟依赖组各片段的平均甲基化程度均低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 烟依赖者CDH23基因甲基化与颈动脉粥样硬化关系

根据CpG246、CpG48位点甲基化中位数(分别为0.010 556、0.056 351),将研究对象分为高甲基化组和低甲基化组,根据研究对象是否烟依赖分为烟依赖组和非烟依赖组,利用析因设计方差分析两种因素(烟依赖和基因位点甲基化)与颈动脉内膜厚度的关系,结果显示,CpG246位点、CpG48位点甲基化水平与颈动脉内膜厚度相关,低甲基化水平时颈动脉内膜厚度显著大于高甲基化水平(F=6.235、4.692,P<0.05)。见表3、4。

表3 CpG246位点2×2析因设计组合动脉内膜厚度比较

表4 CpG48位点2×2析因设计组合动脉内膜厚度比较

3 讨 论

CDH23基因位于染色体10q22.1上,其编码的钙黏附素23是钙黏附素超家族中的一员,钙黏附素是一种跨膜糖蛋白,参与细胞间、细胞内黏附及细胞增殖、信号转导等功能[14]。既往研究认为,CDH23基因甲基化及多态性改变在听力异常[15]、癌症[14]和阿尔茨海默病[16]中发挥作用,近年也有研究发现钙黏附素23与烟依赖也密切相关[5]。蛋白表达受基因调控,CDH23基因甲基化改变是否与烟依赖相关目前尚不清楚,CDH23基因甲基化水平是否与颈动脉粥样硬化相关尚需进一步探讨。

本研究对CDH23基因位点的甲基化水平进行了检测,结果显示烟依赖组CpG246位点、CpG48位点甲基化水平低于对照组,差异有统计学意义,表明烟依赖可能导致CDH23基因位点发生低甲基化改变。有研究表明,70%的GpG岛位于启动子区域,在此区域内甲基化程度与基因表达程度相反[5],因此推测基因甲基化水平的降低可导致CDH23基因表达的增加,其编码的钙黏附素23表达增加,细胞间的黏附功能增强。HUAN等[17]研究发现,许多与吸烟相关的顶级差异表达基因(包括LRRN3和GPR15)在启动子区域都有发生DNA甲基化改变的位点,这些位点在吸烟者中呈现低甲基化改变;随后他们将这些差异表达基因位点与吸烟相关的疾病进行关联分析,结果显示这些基因位点与脑血管疾病及肺部慢性疾病(慢性阻塞性肺疾病、支气管炎等)的发生显著相关。

本文研究进一步结合研究对象烟依赖情况分析CpG246、CpG48两个位点低甲基化水平与颈动脉内膜厚度的关系,结果显示CpG246、CpG48两个位点低甲基化水平时颈动脉内膜厚度显著高于高甲基化水平,推测烟依赖人群中CpG246、CpG48位点的低甲基化水平与颈动脉粥样硬化相关。钙黏附素23介导细胞内和细胞间的黏附,相关研究表明,其主要在神经视网膜、耳蜗和前庭毛细胞的立体纤毛等部位表达[18],同时也在脑、心、血管、肺、肾、鼻、眼等细胞内皮上广泛表达[19]。目前研究认为,颈动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,细胞黏附分子作为关键的成员参与了单核巨噬细胞的聚集、泡沫细胞的形成等环节[20]。尼古丁被认为是烟依赖的主要物质及香烟致病的主要物质,既往研究表明尼古丁可诱导血管内皮细胞功能障碍,促使内皮细胞黏附分子异常表达。细胞黏附异常是动脉粥样硬化发生的始动环节。CDH23基因位点低甲基化改变导致细胞内皮上钙黏附素23表达增加,加强了细胞间的黏附,从而参与了动脉粥样硬化的发生。

此前有大量的研究结果表明,异常的DNA甲基化改变包括异常的低甲基化和高甲基化,在动脉粥样硬化内皮细胞功能障碍、巨噬细胞炎症、血管平滑肌细胞异常增殖、斑块破裂和血栓形成中发挥关键作用[21]。ISTAS等[22]通过综合网络数据分析发现,BRCA1和CRISP2DMRs为大多数中心疾病相关的DNA甲基化生物标志物,这种差异甲基化BRCA1和CRISP2区域通过焦磷酸测序检测得到验证,并可在动脉粥样硬化病人的血液、主动脉组织和颈动脉斑块材料中进一步复制。本研究结果显示,烟依赖者CDH23基因CpG位点发生低甲基化改变,这种低甲基化改变与颈动脉粥样硬化发生密切相关。但本文仅对研究对象外周血样本进行甲基化检测,结果不能完全代表研究对象动脉粥样硬化血管内皮上发生的事件,因此需要进一步取得病人的病理组织标本进行研究以验证本文结论。同时本文样本量相对较少,仍需扩大样本量进一步研究。