姜黄素对人视网膜色素上皮细胞增殖和VEGF表达的影响▲

郑海生 蓝育青 徐家窈 陈海燕 钟兴武

[1 中山大学中山眼科中心海南眼科医院(海南省眼科医院,海南省眼科学重点实验室)眼科,海南省海口市 570311;2 中山大学附属孙逸仙纪念医院眼科,广东省广州市 510120]

在眼底新生血管性疾病中,视网膜缺氧可导致各种细胞因子释放,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被认为是与新生血管联系最紧密的一个因子。无论是在体内还是体外实验中,视网膜色素上皮细胞缺氧均可诱导VEGF表达,从而促进眼内血管新生[1]。因此,寻找一种能有效抑制眼底新生血管性疾病患者视网膜色素上皮细胞增殖和VEGF表达,且毒副作用较少的方法尤为重要。姜黄素具有多种疗效[2-4],其在防治眼底新生血管性病变中可以发挥抗新生血管生成的药理作用。目前有关姜黄素的药物代谢动力学及其在癌症治疗方面的研究较多[5-6],但关于姜黄素对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞的作用研究仍较少。本研究探讨姜黄素对体外培养的hRPE细胞增殖及VEGF表达的影响,为寻找一种安全有效的防治眼底新生血管性疾病的药物提供初步的理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器设备

1.1.1 主要试剂:姜黄素(Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司,批号:SHBL0796),胎牛血清(Biological Industries公司,批号:2033119),波形蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司,批号:M00235),TRIzol试剂盒(TaKaRa公司,批号:AJ91799A),实时荧光半定量PCR试剂盒(TaKaRa公司,批号:RR019A),DMEM-F12培养基(Gibco公司,批号: 61100087)。hRPE细胞由中山大学附属眼科中心医院提供,选第3～6代细胞用于实验。

1.1.2 主要仪器设备:光学倒置显微镜(Leica公司,型号:MPS-30)、Axioplan 2 imaging荧光显微镜(Zeiss公司)、流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,型号:FACSCalibur)、Wellscan MK3酶标仪(Labsystems公司)、GeneAmp 2700型PCR仪(SYNGENE公司)、恒压恒流电泳仪(Bio-Rad公司,型号:PowerPac通用型)、GeneGenius型凝胶成像仪(SYNGENE公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK-8法检测姜黄素对hRPE细胞增殖的影响:取处于对数生长期的hRPE细胞,用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基制备密度为2 500个/mL的细胞悬液,将细胞悬液(100 μL/孔)接种于96孔培养板中,再将96孔培养板置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养24 h;待细胞贴壁生长至单层后弃掉培养液,各浓度组分别在每孔中加入100 μL含终浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL姜黄素的DMEM-F12培养基,同时设置空白对照组(加入等量培养液),再将96孔培养板置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中分别培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d后,弃掉培养液,向每孔中加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基及10 μL CCK-8,继续放入37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱内培养3 h。采用酶标仪检测450 nm波长处的各孔吸光度(OD)值,计算细胞增殖抑制率,并绘制时间-剂量效应曲线。增殖抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100%。每组设4个复孔,实验重复3次。

1.2.2 流式细胞仪检测姜黄素对hRPE细胞周期时相的影响:取处于对数生长期的hRPE细胞,以5×105个/mL的密度接种于25 mL培养瓶中,每瓶5 mL,24 h后加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基,继续放入37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱内培养24 h,然后吸出DMEM-F12培养液,各浓度组再加入5 mL含终浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL姜黄素的DMEM-F12培养液作用24 h,设置空白对照组并加入等量培养液,收集贴壁细胞,采用流式细胞仪分析细胞周期分布情况。每组实验重复3次。

1.2.3 实时荧光半定量PCR检测姜黄素对hRPE细胞VEGF mRNA表达水平的影响:(1)细胞分组和处理。取处于对数生长期的hRPE细胞,以5×105个/mL接种于六孔板中,每孔2 mL,将其分为对照组和姜黄素组。对照组细胞仅加入2 mL DMEM-F12培养液,姜黄素组加入用细胞培养液稀释的终浓度为10 μg/mL的姜黄素,每组设4个复孔,放入37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱内培养24 h。(2)PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。VEGF上游引物序列为5′-GACAAGAAAATCCCTGTGGGC-3′,下游引物序列为5′-AACGCGAGTCTGTGTTTTTGC-3′,扩增片段理论长度为102 bp;内参β-actin上游引物序列为5′-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3′,下游引物序列为5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′,扩增片段理论长度为 428 bp。(3)实时荧光半定量PCR。采用TRIzol试剂盒提取各组细胞的总RNA,将RNA反转录合成cDNA。以cDNA为模板,按实时荧光半定量PCR试剂盒说明书步骤扩增目的基因。反应体系为10×PCR Buffer Ⅱ 5 μL,dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL,上下游引物各0.5 μL,TaKaRa Ex TaqTMHS(5 U/μL)0.5 μL,cDNA模板 4.5 μL,加RNase Free dH2O至50 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min;共进行33个循环,末次循环后72 ℃延伸8 min。(4)PCR扩增产物电泳。取4 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测其完整性;摄像后利用凝胶图像扫描分析软件分析电泳结果,测定电泳条带的光密度值。以VEGF的PCR产物含量与β-actin的PCR产物含量的比值来表示VEGF mRNA相对表达水平。实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度姜黄素对hRPE细胞增殖的影响 各浓度姜黄素(浓度≥5 μg/mL)对hRPE细胞均有抑制作用(均P<0.05),且随着药物浓度的增大、作用时间的延长,其抑制率呈升高趋势,整体呈现剂量和时间依赖性。见表1。

表1 不同浓度姜黄素对hRPE细胞增殖的影响(x±s)

组别n培养4 dOD值(x±s)抑制率(%)培养5 dOD值(x±s)抑制率(%)培养6 dOD值(x±s)抑制率(%)5 μg/mL姜黄素组30.554±0.010a64.00.602±0.015a62.70.591±0.022a63.610 μg/mL姜黄素组30.510±0.014ab66.90.564±0.023ab65.10.518±0.016ab68.120 μg/mL姜黄素组30.114±0.009abc92.60.096±0.016abc94.10.036±0.012abc97.840 μg/mL姜黄素组30.103±0.012abcd93.30.089±0.012abcd94.50.030±0.008abcd98.2空白对照组31.542±0.009—1.612±0.015—1.621±0.013— F值8 562.2044 188.6535 653.264P值<0.001<0.001<0.001

2.2 不同浓度姜黄素对hRPE细胞周期时相的影响 各浓度姜黄素组的G0/G1期细胞比例均大于空白对照组,S期细胞比例和G2/M期细胞比例均小于空白对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 各组hRPE细胞周期 时相分布情况的比较(x±s,%)

2.3 姜黄素对hRPE细胞VEGF mRNA相对表达水平的影响 因20 μg/mL和40 μg/mL姜黄素对细胞增殖的抑制作用太强,而5 μg/mL姜黄素的抑制性偏弱,所以选择10 μg/mL姜黄素进行该实验。结果显示,姜黄素组hRPE细胞VEGF mRNA相对表达水平低于对照组(P<0.05),见表3。

表3 两组hRPE细胞VEGF mRNA 相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

姜黄素是一种药理作用广泛的传统中药,其药源广,价格低廉,无明显毒副作用,目前美国食品药品监督管理局将其作为21世纪抗癌新药[7],并且已有学者研究姜黄素的药物代谢动力学及其治疗癌症的生物有效剂量[8-9]。而姜黄素在眼科疾病中应用的研究主要集中于其抗新生血管生成的作用,多项研究显示,姜黄素可能在翼状胬肉、角膜碱烧伤和糖尿病视网膜病变等疾病的治疗中发挥重要作用[10-12]。龚凌等[13]发现姜黄素可明显抑制人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖。本研究结果显示,各浓度姜黄素(浓度≥5 μg/mL)对hRPE细胞均有抑制作用(均P<0.05),且随着药物浓度的增大、作用时间的延长,其抑制率呈升高趋势,整体呈现剂量和时间依赖性。本研究结果还显示,各浓度姜黄素组的G0/G1期细胞比例均大于空白对照组,S期细胞比例和G2/M期细胞比例均小于空白对照组(均P<0.05)。这说明姜黄素可以将hRPE细胞周期阻滞于S期,即进入细胞增殖期的hRPE细胞比例降低,这可能是姜黄素抑制hRPE细胞增殖的重要原因之一[14]。李松霖等[15]的研究结果显示,姜黄素作用于Lewis肺癌细胞24 h 后,Lewis肺癌细胞的凋亡率升高至7.43%,且姜黄素可以将Lewis肺癌细胞周期阻滞于S期。这与本研究结果相似。

视网膜色素上皮细胞在视网膜新生血管性疾病的发生和发展中发挥非常重要的作用,在缺氧的环境下视网膜色素上皮细胞可诱导VEGF表达,而VEGF在视网膜新生血管病变中起着非常重要的作用。Vasquez等[16]发现姜黄素既能抑制缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞VEGF表达上调,又能抑制脉络膜血管细胞的血管生成;Mrudula等[10]发现,姜黄素可以抑制糖尿病大鼠视网膜VEGF的表达,从而抑制眼底新生血管生成。因此我们提出假设:姜黄素可通过抑制hRPE细胞分泌VEGF,从而起到抑制眼底新生血管增生的作用。本研究通过实时荧光半定量PCR检测姜黄素对hRPE细胞VEGF mRNA表达水平的影响,对姜黄素防治眼底新生血管性疾病的分子机制进行初步探索。结果显示,姜黄素组hRPE细胞VEGF mRNA相对表达水平低于对照组(P<0.05),说明姜黄素能下调hRPE细胞VEGF mRNA的表达,与上述研究结果基本一致。然而姜黄素在下调hRPE细胞VEGF mRNA相对表达水平的同时,是否也能下调其蛋白表达水平尚需进一步研究。

综上所述,姜黄素可以将hRPE细胞周期阻滞于S期,从而抑制hRPE细胞的增殖,还可以降低hRPE细胞的VEGF mRNA表达水平。这为进一步的体内实验提供了研究基础,为姜黄素防治眼底新生血管性疾病的新药研发提供了初步的理论依据。