转化生长因子β1通路在IgA肾病中作用机制的研究进展▲

孙昭恒 丁 樱 郭 婷 黄文龙

(1 河南中医药大学儿科医学院,河南省郑州市 450046;2 河南中医药大学第一附属医院儿科医院,河南省郑州市 450000)

【提要】 IgA肾病的发生、发展与机体异常免疫、肾脏炎症反应、足细胞及肾小管上皮细胞的流失、细胞外基质的形成密切相关。转化生长因子β1(TGF-β1)作为一种多功能细胞因子,不仅在维持免疫耐受、调节免疫应答方面发挥重要作用,还能够调节多种类型细胞的生长、趋化、分化和凋亡,它的表达和活化与IgA肾病的发生、发展密切相关,对疾病后期肾纤维化的形成有重要作用,是影响患者预后的关键因素。通过TGF-β1 信号通路寻找治疗IgA肾病的分子生物学靶点成为IgA肾病治疗的新方向。现对TGF-β1通路在IgA肾病中的分子生物学机制进行综述。

IgA肾病是全球最常见的原发性肾小球肾炎[1],其特点是以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区、毛细血管壁沉积[2],临床表现包括无症状的尿检异常(镜下血尿和/或蛋白尿)、有明显症状的肾脏异常(肉眼血尿、肾病综合征),甚至进行性肾功能不全,高达50%的患者在确诊后的20年内发展为终末期肾脏病[3]。既往研究表明,IgA肾病是由免疫炎症介导的肾小球肾炎,但其发病机制尚未被完全阐明,目前最为公认的发病机制为多重打击学说[4]:循环血中半乳糖缺乏的IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)水平升高,N-乙酰半乳糖胺暴露(打击1),被IgG和/或IgA1同型的天然抗聚糖抗体所识别(打击2),形成包含Gd-IgA1的循环免疫复合物,聚集在肾小球的系膜区(打击3),刺激系膜细胞增殖,分泌系膜基质、细胞因子、趋化因子、生长因子等,同时激活补体系统,引起肾脏的免疫炎症反应和纤维化改变(打击4)。在这一系列复杂的免疫应答中,转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)作为一种多效性的信号分子,能够激活多种复杂的信号通路,在IgA肾病发生与发展的不同阶段起到不同的作用。本文总结了TGF-β1在IgA肾病发病不同阶段的作用机制,对TGF-β1通路相关靶向药物的研究进展进行综述,旨在为调控 TGF-β1 通路治疗IgA肾病提供理论依据。

1 TGF-β1通路概述

TGF-β家族有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5五种亚型,但哺乳动物仅有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型,它们虽然有着相似的分子结构,但由于氨基酸序列和激活状态的不同,各亚型显示出不同的功能和特性[5]。TGF-β1是含量最丰富的亚型,可由各种类型的肾细胞和炎症细胞合成,它与TGF-β潜伏期相关蛋白、TGF-β结合蛋白形成潜在的复合体,分泌于细胞外基质中[6]。未被激活的TGF-β1在丝氨酸蛋白酶纤溶酶、活性氧、凝血酶反应蛋白1或整合素的作用下,经过蛋白水解而被激活[7-8]。被激活的TGF-β1与受体相互作用,可激活SMAD依赖和SMAD非依赖的下游信号[9-10],被激活的TGF-β1还可以与TGF-β Ⅱ型受体(TGF-β type 2 receptor,TBR2)相结合,导致TGF-β Ⅰ型受体(TGF-β type 1 receptor,TBR1)发生磷酸化并募集,这种TGF-β1-TBR1-TBR2的活化复合物可使SMAD2和SMAD3发生磷酸化,然后磷酸化的SMAD2、SMAD3进一步与SMAD4结合,形成SMAD复合物,从而反向调节编码基因(如胶原蛋白、纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白)和SMAD7基因的转录[11-12]。此外,TGF-β1还可以直接激活其他信号转导通路。这些途径包括丝裂原激活蛋白激酶途径[12]、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途径[13-14]、小鸟苷三磷酸结合蛋白(如Ras、Rho、Rac、Cdc42)、NOTCH信号通路[15-16]、整合素连接激酶与Wnt/β-连环素途径[17-18],它们既可以作为独立的信号通路,也可以作为汇聚到SMAD上的信号通路来抑制SMAD的活性,从而介导信号传导。这些复杂的信号通路在TGF-β1调节细胞生长、分化、细胞外基质形成、免疫抑制等过程中起重要作用[19-20]。

TGF-β1的表达和活化与IgA肾病的发生、发展密切相关。一项队列研究表明,IgA肾病患者血清TGF-β1水平升高,血清TGF-β1水平与血清IgA、分泌型IgA和Gd-IgA1水平,以及IgA肾病病理分型相关[21]。还有研究显示,IgA肾病患者外周血γδT细胞细胞核中TGF-β1水平升高[22]。另一项研究表明IgA肾病患者血清和肾小球中TGF-β1蛋白和mRNA的表达水平明显高于健康人群,且随WHO关于IgA肾病病理分级的增加而增加[23]。以上研究均证明TGF-β1是IgA肾病发生与发展的关键因子。

2 TGF-β1在IgA肾病启动环节中的作用:稳定或诱发

人体具有复杂的免疫机制,可以在准确清除细菌、病毒、真菌、寄生虫等致病因素的同时,不对自身造成影响,从而维持机体平衡,这是由针对特定病原的效应器产生的免疫反应,以及调节性T细胞和抑制性细胞因子提供的反馈调节环路完成的[24]。调节性T细胞可以分为三种主要的CD4+调节性T细胞[25-27],其中两种表达转录因子叉头盒蛋白P3(forkhead box protein P3,FOXP3),可在天然调节性T细胞或诱导性调节性T细胞自然诱导下,抑制促炎因子的产生,对维持自身免疫耐受起着关键作用。第三种是Ⅰ型调节性T细胞,它不表达转录因子FOXP3,但在抗原刺激下可以分泌白细胞介素(interleukin,IL)-10和TGF-β1[28-30]。TGF-β1一方面能够抑制Th1细胞、Th2细胞和细胞毒性T淋巴细胞的活性,诱导幼稚CD4+调节性T细胞产生转录因子FOXP3[31-32],并通过调节FOXP3+调节性T细胞抑制T细胞反应,在抑制T细胞反应中起着至关重要的作用[25];另一方面,TGF-β1可以抑制外周幼稚CD4+和CD8+T细胞的增殖、存活和反应性[33-34],对维持外周免疫稳态和保持T细胞抵御病原的侵害至关重要。既往研究发现,TGF-β1基因缺失的小鼠出生后会因全身炎症反应而迅速死亡[35],这说明TGF-β1在抑制自身免疫性炎症反应中起关键作用。

TGF-β1通路的激活可能与IgA肾病的发生相关。TGF-β1通路的激活进一步诱导原始T细胞分化为具有促炎作用的Th17细胞[36-37],介导机体的前炎症反应,并与IL-10或IL-21一起诱导CD40激活的B细胞转变为IgA+B细胞[38]。记忆B细胞在机体初次感染后即可形成,并在二次免疫反应中迅速产生以IgA为主的免疫球蛋白[39],这个过程促进了血液中IgA类抗体的大量形成。此外,TGF-β1还是一种IgA类转换因子[40-41],它可通过SMAD2/3通路有效、独立地激活抗体类别转换[42]。如研究表明,TGF-β1可以负向调节B细胞的存活、增殖,并在成熟的B细胞向产生IgA的浆细胞分化的过程中,诱导免疫球蛋白与IgA发生类别转换,促进IgA类抗体的产生[43]。同时,一些细胞因子也可以增强这种转换能力,如IL-10及其他细胞因子可以促进TGF-β1介导的IgA发生抗体类别转换[44-46]。也有研究发现,由滤泡辅助T细胞产生的TGF-β1和IL-21可以协同产生丰富的IgA浆母细胞。在IL-21的作用下,TGF-β1可促进幼稚B细胞的增殖和分化,并抑制IL-21诱导的IgG发生抗体类别转换,从而促进IgA类抗体的产生[47],这些TGF-β1的相关通路促进了IgA类抗体的产生,使循环血中的IgA类免疫复合物增加,从而诱发IgA肾病的发生。

3 TGF-β1在IgA肾病发展环节中的作用:修复或破坏

在IgA肾病发展的不同阶段,TGF-β1也发挥着不同的作用。在肾损伤早期的肾脏修复过程中,TGF-β1被证明是一种抗炎细胞因子[48]。最近研究表明,在新月体肾炎的小鼠模型中,TGF-β1会抑制炎症细胞因子的释放及巨噬细胞和CD3+T细胞的浸润,以保护受损的肾脏[49]。TGF-β1也被证明可促进巨噬细胞由促炎的M1向抗炎的M2表型转变[50],这些短期内通路的激活有利于肾脏的修复。然而,TGF-β1也会加重炎症反应。随着病情进展,IgA相关的免疫复合物沉积于肾脏,其与系膜细胞结合并被激活,触发肾小球和肾间质损伤,使得肾小球滤过屏障受损,足细胞和近端肾小管上皮细胞很可能被持续暴露在IgA相关的免疫复合物中[51],这种持续的细胞水平的损伤促进了局部纤维蛋白凝块的形成,并激活受损细胞的先天免疫反应[52-54],在这种炎症反应下,受损的各类肾细胞及浸润的炎症细胞释放细胞因子、趋化因子和生长因子,其中就包括TGF-β1,TGF-β1又能自我诱导内源性TGF-β1的合成,使TGF-β1进一步增多[55]。这些TGF-β1可使炎症细胞聚集到损伤部位[56],进一步加重肾小球、肾间质中的炎症反应。最近研究显示,TGF-β1对炎症反应是驱动还是抑制,是由细胞外TGF-β1的水平及暴露于TGF-β1时细胞内和细胞外的局部因素所决定的[57],这提示TGF-β1或许可以成为控制炎症反应的重要靶点。

足细胞、足突是肾小球滤过膜的重要组成部分,正常情况下,足细胞通过自噬来维持其稳态[58],而IgA肾病过程中,足突广泛融合,破坏足细胞自噬,导致足细胞功能障碍,出现形态异常、凋亡甚至脱落。随着IgA肾病的进一步发展,肾小球滤过膜受损,患者往往出现蛋白尿、血尿。有研究显示,由IgA肾病患者血液中的IgA1与系膜细胞组成的培养液可以诱导足细胞凋亡[59]。最近一项研究发现,TGF-β1可以通过激活雷帕霉素靶蛋白复合物通路来抑制足细胞自噬[60],从而破坏其稳态,并抑制足细胞内主要细胞骨架蛋白的表达[61],导致足细胞功能障碍。同时,TGF-β1和C-X-C基序趋化因子配体1的协同作用又可以通过C-X-C基序趋化因子受体2进一步诱导足细胞凋亡[62],这又造成足细胞的大量丢失,而足细胞丢失已被证实与IgA肾病的严重程度和疾病进展有关[63]。此外,受到IgA1刺激的系膜细胞又通过串扰激活足细胞的肾素-血管紧张素系统,使足细胞合成TGF-β1增多,从而使上述损伤加重[64-65]。文献显示,局部肾素-血管紧张素系统的激活和TGF-β1的合成是肾损伤的主要因素[66]。上述研究提示,在IgA肾病中,受到IgA相关免疫复合物刺激的肾小球系膜细胞可能通过促进TGF-β1的产生而加速疾病进展。

4 TGF-β1在IgA肾病后期进展中的作用:纤维化的形成

纤维化是指大量激活的成纤维细胞沉积形成富含胶原的细胞外基质,逐渐替代健康的实质组织,导致正常组织功能丧失,几乎任何重复损伤或持续性损伤的组织都可以发展成纤维化。TGF-β1通路短期的激活可促进肾脏损伤修复,而持久的激活会导致肾脏纤维化。TGF-β的促纤维化作用最初是在动物研究中被发现的,研究团队给新生小鼠皮下注射TGF-β后发现,TGF-β可刺激注射部位肉芽组织增生,并刺激成纤维细胞中胶原的形成[67]。最近研究发现,TGF-β1主要通过TGF-β1受体的激活、SMAD3的磷酸化和核转位来促进肾纤维化的发展。在慢性肾脏病中,TGF-β1不仅能够作用于肾脏系膜细胞和成纤维细胞,诱导细胞增殖、迁移,激活和转录促纤维化分子,包括胶原、纤维连接蛋白和纤溶酶原激活物抑制物1[68-70],还能够调节蛋白质和miRNA的表达,影响组织胶原的积累,诱导超过12种蛋白质与胶原蛋白的表达,这些蛋白都是胶原蛋白在组织中大量表达、积累所必需的。胶原蛋白被诱导表达后,自发地结合成微纤维,同时,TGF-β1诱导纤维连接蛋白、赖氨酰氧化酶、胶原周转抑制物等的表达,使这些物质成为稳定的基质纤维胶原,从而导致肾的纤维化[7]。

肾小球系膜细胞通过提供正确的机械张力,产生各种细胞因子、生长因子和金属蛋白酶,调节细胞外基质的转换,维持肾小球正常的功能。因此,肾小球系膜细胞也是慢性进行性肾脏疾病进展为肾脏纤维化的主要效应细胞[71],在多种因素触发下,IgA肾病患者的肾小球系膜细胞被炎症细胞因子激活,从而过度增殖[72],其增殖过程分泌大量TGF-β1[73],不仅进一步促进肾小球系膜细胞的增殖,还导致肾小管间质的纤维化。进行性的肾小管间质纤维化由生长因子、代谢毒素及应激分子等多种介质调控[74-76],TGF-β1被认为是其中关键的介质[77-79]。TGF-β1触发肾小管上皮细胞转化为间充质细胞来诱导纤维化,这一过程被称为上皮-间质转化[80]。同时,在肾小管上皮细胞中,TGF-β1可诱导自噬相关蛋白Beclin 1、自噬相关基因ATG5和ATG7的表达,并以时间和剂量依赖的方式促进自噬小体的聚集[81]。已有研究表明,这种TGF-β1驱动的自噬是肾小管分解的一种新机制,可导致肾间质纤维化:在疾病的初期,肾小管细胞内源性的TGF-β1可促进肾小管周围细胞的增殖和胶原沉积;在疾病后期,TGF-β1的表达量持续升高,并通过调节细胞自噬过程使肾小管细胞完全分解,其分解的残留物嵌入致密的胶原纤维组织中,导致管状基底膜空洞、塌陷,引起广泛的肾小管周围纤维化和局灶性肾单位变性[82],使肾脏失去正常的组织结构,从而丧失正常功能。生物信息学研究发现,TGF-β1/SMAD3介导的以Src为中心的调控网络诱导的巨噬细胞向肌成纤维细胞转化是肾脏慢性炎症进展为肾脏纤维化的关键靶点。Src位于差异表达基因网络的中心,是一种广泛表达的非受体蛋白酪氨酸激酶,可被多种细胞表面受体激活,参与多种信号通路[83]。近期研究表明,Gd-IgA1和血浆凝溶胶蛋白可通过TGF-β1/SMADs信号通路发挥协同作用,这也可能是诱导IgA肾病患者肾小球纤维化的一个潜在机制[84]。

5 TGF-β1在IgA肾病治疗中的应用

基于TGF-β1治疗IgA肾病的策略中,大致可分为以下两种:(1)通过反义寡核苷酸、干扰RNA或中和抗体等方式直接抑制TGF-β1的功能或表达[85-87];(2)通过血管紧张素转换酶抑制剂或阻断血管紧张素Ⅱ受体等间接作用,减少肾组织TGF-β1的合成[88-90]。然而,如果直接靶向调控TGF-β1,TGF-β1的关键生理功能可能会由于TGF-β1通路的完全阻断而中断,包括抑制异常免疫、控制炎症反应、维持自身耐受和预防自身免疫性疾病,继而导致炎症反应的增加,这种不利影响在小鼠身上表现得尤为突出[91]。因此,针对TGF-β1通路寻找新的靶点,以治疗包括IgA肾病在内的慢性肾脏病,逐渐成为研究的热点。在IgA肾病中,SMAD3被过度激活,上皮-间质转化形成,加上炎症细胞的聚集和胶原蛋白的积累,使得TGF-β1/SMAD3通路中的SMAD7降解被抑制[92],进而使体内TGF-β1/SMAD3/SMAD7信号传导趋于平衡,以有效减少疾病后期的肾脏纤维化。3-去氮腺嘌呤A可以通过抑制zeste基因增强子同源物2的表达、增加SMAD7和磷酸酯酶与张力蛋白同源物的表达来抑制TGF-β1/SMAD3信号转导,从而抑制肾肌成纤维细胞的激活和肾纤维化的发展,还能有效抑制肾小管上皮细胞阻滞在G2/M期,减少TGF-β1和结缔组织生长因子的产生,减轻单侧输尿管梗阻小鼠模型肾的纤维化[93]。细胞分裂自身抗原1是最近发现的TGF-β1信号的增强因子,也是抗炎因子NAD-依赖性去乙酰化酶sirtuin-1的抑制剂。以细胞分裂自身抗原1为靶点,采用干扰RNA技术抑制其表达,可以减弱TGF-β1诱导的SMAD3磷酸化,使纤维化靶基因的表达降低,从而抑制肾脏纤维化。该干预方法不会完全阻断TGF-β1信号而影响其关键生理功能[94],与直接靶向调控TGF-β1或其受体相比,干扰细胞分裂自身抗原1表达的安全性更好,因此,细胞分裂自身抗原1可能是减少肾脏纤维化的有效、安全的靶点[95]。另有研究表明,肿瘤抑制因子p53是TGF-β1纤维化反应基因转录的协同调节因子,其可以与TGF-β1激活的SMADs通路结合,而通过药理学和遗传学方法靶向下调p53的表达,可以减弱相关基因的表达,减轻纤维化反应[96]。此外,一些促纤维化的下游效应因子也可能成为抑制纤维化的靶点。如纤溶酶原激活物抑制物1是一种丝氨酸蛋白酶抑制物[97],能够抑制纤溶酶原激活系统。研究发现,纤溶酶原激活物抑制物1的特异性抑制剂SK-216可以阻断TGF-β1通路诱导的上皮-间质转化,减少A549细胞产生的纤溶酶原激活物抑制物1和内源性TGF-β1,从而减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化程度,这个过程可能不是通过抑制SMAD或由细胞外调节蛋白激酶通路介导的[98],但仍可以作为一个潜在的抑制肾脏纤维化的靶点。

6 小结与展望

TGF-β1信号通路在IgA肾病的启动环节、发展环节及后期进展环节中均起到重要作用,它可以维持免疫耐受、发挥抗炎效应,又能在特定情况下加重炎症反应,促进体内免疫复合物的产生;它既是肾脏损伤时细胞愈合的主要调节者,也可能会使平衡从生理性修复转向过度的病理修复,产生以胶原瘢痕组织堆积、硬化为特征的纤维化,损害器官功能,导致器官功能衰竭。后续还需进一步研究IgA肾病中各类异常免疫应答之间的关系,明确疾病不同阶段 TGF-β1 信号通路的表达情况和相应的分子机制,深入了解 TGF-β1 信号通路在IgA肾病发生与发展中的作用机制,寻找安全、有效的靶点,为IgA肾病的靶向治疗提供指导依据。