超高效液相色谱-串联质谱法在白酒甜味剂检测中的应用

◎ 莫凤萍，褚丽琼，金晓兰

（广西壮族自治区产品质量检验研究院，广西 南宁 530200）

我国白酒属于蒸馏酒，备受人们喜爱。我国现行《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）规定，白酒中不允许添加非发酵物质[1]。虽然添加甜味剂能提高酒的甜度，但甜味剂是一种人造的、无发酵的原料，过量使用会对人体器官造成损伤。因此，白酒中甜味剂检测在食品安全领域中是重点关注内容[2]。

当前，对白酒中的甜味物质进行测定的方法有气相色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等[3]。为了准确检测出甜味剂的检出限，高效液相色谱-串联质谱法在白酒甜味剂检测中被广泛应用，它可同时对白酒中的多种甜味剂进行准确分析，有效检测白酒中的微量甜味剂，保障白酒的食品安全和质量[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵、乙酸（色谱纯，美国ACS 恩科化学公司）；实验用水为超纯水[5]。标准物质：纽甜标准品、安赛蜜标准品、甜蜜素标准品、阿斯巴甜标准品、糖精钠标准品、三氯蔗糖标准品、阿力甜标准品、甜菊糖苷标准品、甜菊双糖苷标准品、新橙皮苷二氢查尔酮标准品（纯度均≥98%）[6]。本试验白酒样品市购。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；4000 QTRAP 三重四极杆质谱仪（美国ABSciex公司）；VORTEX3 型圆周振荡器（德国IKA 公司）；数控超声波清洗器（美国Ameritech 公司）；MilliQ型超纯水系统（美国Millipore 公司）；0.22 μm 有机滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.3 检测条件

1.3.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm×1.8 µm）；流动相：A 为有机相，B 为水相，分别为甲醇和0.1%乙酸水溶液；梯度洗脱条件：0 min，5%A；0 ～7.5 min，5%A →85%A；7.5 ～13.0 min，5%A；柱温为35 ℃；检测波长：230 nm；进样量为5 µL；流速0.4 mL·min-1。

1.3.2 质谱条件

电喷雾负离子（ESI-）；多反应监测（MRM）模式；离子源温度150 ℃；毛细管电压2.5 kV；脱溶剂气温度为400 ℃；脱溶剂气流速700 L·h-1；锥孔气流速50 L·h-1；碰撞气为氩气，气流速0.15 mL·min-1。

1.4 标准溶液的配制

将10种甜味剂标准品精确称量10 mg，并置于10 mL容量的瓶子中，采用超纯水定容，制成1.00 mg·mL-1的单标储备溶液，保存于4 ℃冰箱中。准确量取各个单标储备溶液0.1 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，用水定容配制0.01 mg·mL-1的混合标准工作液，保存于4 ℃冰箱中。根据使用需要，用空白基质溶液将标准工作液稀释成标准系列溶液。

1.5 样品前处理

由于白酒乙醇含量较高，对其进行蒸发脱醇。吸取白酒样品2.0 mL 经旋转蒸发仪脱醇后，于10 mL 容量瓶中用纯水定容、混匀，经0.22 μm 滤膜过滤，供超高效液相色谱-质谱联用仪分析，提高检测的准确性和精确度。

2 结果与分析

2.1 液相条件的选择

选择BEH HSS T3 柱对10 种甜味剂进行分离，同时需要确定合适的液相条件。有机相选择甲醇、乙腈，水相选择0.1%甲酸、5 mmol·L-1乙酸铵和0.1%乙酸溶液。由于乙腈毒性相对较大，对操作者有潜在的危害，故选择0.1%甲酸溶液-甲醇、5 mmol·L-1乙酸铵溶液-甲醇、0.1%乙酸溶液-甲醇3 种流动相体系。通过实验，对比3 种流动相体系的待测物质在色谱柱上的分离度、峰形、灵敏度、稳定性，0.1%乙酸溶液-甲醇最好，且质谱响应良好，故选用0.1%乙酸溶液-甲醇梯度洗脱。

2.2 质谱条件的选择

对甜味剂标准品进行全扫描检测，找到10 种甜味剂的母离子，再用惰性气体轰击该母离子，获得相应的子离子。从10 种甜味剂的分子结构看，在负离子电离模式下分子离子峰强度较高。采用多反应监测模式（MRM）优化质谱参数，调节毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量、脱溶剂气流速和锥孔气流速等，使分子离子峰度和信号达到最强，在最佳质谱条件参数下测定甜味剂。10 种甜味剂相关质谱参数见表1。

表1 10 种甜味剂相关质谱检测参数表

2.3 线性关系及标准曲线

将10 种甜味剂混合标准工作液用空白基质溶液稀释，配制浓度分别为20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1的标准系列溶液，按照上述条件进行测定，绘制标准工作曲线，得出线性方程，线性范围为20 ～1 000 μg·L-1，相关系数（r2）都大于0.999 2，在测定范围内均有良好的线性。分别用信噪比（S/N=3、S/N=10）确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。10 种甜味剂的LOD 在0.5 ～3.2 μg·L-1，LOQ 在1.7 ～10.7 μg·L-1，三氯蔗糖甜味剂的定量限最高，甜蜜素甜味剂的定量限最低，相关参数见表2。

表2 10 种甜味剂的标准曲线及检出限表

2.4 方法的回收率与精密度

在不含分析物本底的白酒中添加高、低两种不同浓度的混合标准溶液，每个添加水平做5 次平行实验，并用超高效液相色谱-串联质谱检测法测定，计算出不同浓度下的加标回收率和相对标准偏差（RSD），具体数据见表3。由表3 可知，2 个添加水平下的10 种甜味剂的回收率为88.5%～102.5%，相对标准偏差（RSD）为0.8%～2.1%（n=5），该方法的准确度和精密度较好。

表3 10 种甜味剂的加标回收率和精密度表（n=5）

2.5 样品测定

按照上述建立的检测方法，对8个白酒样品（1#～8#）进行了10 种甜味剂含量的测定。其中，2#检测出糖精钠21.5 μg·L-1，3#检测出纽甜22.6 μg·L-1，其余6 个白酒样品未检测出甜味剂。

3 结论

实验表明，采用超高效液相色谱-串联质谱法可以同时测定10 种白酒甜味剂。白酒样品经蒸发脱醇、纯水定容后进行检测，甜味剂组分方法LOD在0.5 ～3.2 μg·L-1，LOQ 在1.7 ～10.7 μg·L-1。在30 μg·L-1和500 μg·L-1的不同加标水平下，10 种甜味剂的回收率为88.5%～102.5%，相对标准偏差（RSD）为0.8%～2.1%。利用此方法可以在13 min 内完成白酒甜味剂的准确筛查，满足日常检测和市场监测的需求。