元和正胃片质量标准提升研究

朱日，陈笑宇，李冬冬，赵诗聪，吴香婷，刘英链，杨锦竹※，金向群※

（1.吉林大学药学院，吉林 长春 130021；2.吉林省正和药业集团股份有限公司，吉林 通化 134001）

元和正胃片由通化正和药业有限公司研制生产，收录于局颁药品标准[标准号：WS-10993（ZD-0993）-2002]。处方由龙胆、大黄、甘草、木香、丁香等7 味中药和碳酸氢钠组成。工艺为木香300 g、丁香20 g、薄荷25 g 用水蒸气蒸馏法提取挥发油6 h，蒸馏后水溶液及挥发油备用；药渣加水煎煮2 h，滤过，滤液备用；大黄300 g、龙胆300 g、延胡索200 g、甘草200 g 加水煎煮2 次，每次2 h 时，分次滤过，合并滤液，与上述蒸馏后的水溶液及水煎液合并，减压浓缩至相对密度为1.30~1.35（60~70 ℃）的稠膏，干燥，粉碎成细粉，加入碳酸氢钠粉末600 g，混匀，上述挥发油用少量乙醇溶解，均匀喷入，混匀，压片，制成1 000 片，即得。本品为棕褐色片剂，气香、味咸、微苦。主要用于治疗胃痛、胃胀反酸、饮食积滞、消化性溃疡等。处方中的龙胆有降胃气、清胃热、补胃汁的功效[1]，能促进胆汁及胃液的分泌[2]；大黄作为泻下药的代表，常用于胃火炽盛、肠道积滞、便秘等症状[3]；甘草中有效成分具有抗胃癌作用[4]，甘草水提物能够恢复细胞周期，促进肠隐窝细胞增殖，有效修复消化道溃疡[5]，同时具有治疗脾胃虚弱、咳嗽痰多的作用[6]；木香促进胃肠运动、停止腹泻、利胆和抗溃疡等作用[7]；丁香促进消化系统功能等[8]，均为该方中起主要药理作用的组分。现行标准包括大黄素、大黄酚、丁香酚和延胡索的鉴别以及碳酸氢钠、大黄素和大黄酚含量的测定，但未对甘草或其有效成分进行鉴别或测定。本研究建立元和正胃片中甘草的TLC 鉴别和甘草苷、甘草酸含量测定的方法，为元和正胃片质量标准的完善提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

S3000 型高效液相色谱仪（华谱科技有限公司）；InertSustainSwift-C1（84.6 mm 250 mm，5m）色谱柱（岛津实验器材有限公司）；KQ-250DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限责任公司）；TDL-40B离心机（华谱科技有限公司）；SZ-9B 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；BT 25s 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试剂与材料

元和正胃片（0.75 g/片，批号210804、211102、211206，吉林省正和药业集团股份有限公司提供）；甘草酸铵对照品（批号110731-201619，中国食品药品检定研究院）；甘草苷对照品（批号111610-201106，中国食品药品检定研究院）；甘草对照药材（批号120904-201620，中国食品药品检定研究院）；Gf254 硅胶板（批号20210118，青岛海洋化工有限公司）；乙腈、磷酸为色谱纯；水为双蒸水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 甘草的TLC鉴别

取元和正胃片10 片，研磨成粉末，取粉末约6 g，加入70%乙醇溶液30 mL，超声处理（功率250 W）30 min，离心，取上清液，通过微孔滤膜过滤，作为供试品。按处方用量制备甘草阴性样品，同法制得阴性样品溶液。取甘草对照药材0.5 g，同法配制对照药材溶液。取甘草酸铵对照品，加70% 乙醇制成每1 mL 含0.5 mg（含甘草酸0.489 9 mg）的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5L，点于同一硅胶Gf254 板上，以正丁醇水 乙酸（6:3:1）的上层溶液作为展开剂[9]，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，结果见图1。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显现相同的荧光斑点，阴性样品无干扰。

图1 TLC 图谱Fig.1 TLC chromatogram

图2 HPLC 图谱Fig.2 HPLC chromatograms

2.2 甘草苷、甘草酸的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：InertSustainSwift-C18 柱（4.6 mm 250 mm，5m），流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0~30 min，15 %A；30~33 min，15%~32%A；33~65 min，32%A；65~80 min，32%~38%A；80~90 min，38%~90%A）；流速：1 mL/min；检测波长：237 nm；柱温：25 ℃；进样量：10L。

2.2.2 对照品溶液的制备 称取甘草苷、甘草酸铵（甘草酸质量=甘草酸铵质量0.979 7）对照品，加70%乙醇制成浓度分别为0.024、0.102 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取元和正胃片研磨成粉末，取约4 g，加入70%乙醇溶液30 mL，称重，超声振动（功率250 W）30 min，放冷，用70%乙醇补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方称取其余药材和碳酸氢钠，提取、制粒得到甘草阴性样品。按“2.2.3”方法进行处理，得到阴性对照溶液。

2.2.5 专属性考察 将“2.2”各溶液用微孔滤膜过滤，注入HPLC 仪器中进行测定，色谱图见图1。由图谱可知，甘草苷、甘草酸与其他峰分离良好，阴性样品对目标成分的测定无干扰。

2.2.6 线性关系考察 取“2.2.2”混合对照品溶液，用70%乙醇逐级稀释，得到甘草苷浓度为0.024 mg/mL、0.018 mg/mL、0.012 mg/mL、0.009 mg/mL、0.006 mg/mL、0.003mg/mL（对应甘草酸铵浓度为0.102mg/mL、0.0765 mg/mL、0.051 mg/mL、0.038 25 mg/mL、0.025 5 mg/mL、0.012 75 mg/mL）的系列混合对照品溶液。依次进样测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，甘草苷、甘草酸的质量浓度为横坐标，绘制相应的标准曲线。得到甘草苷的回归方程为y=24 576x+11.782，R2=0.999 6，线性范围为0.003~0.024 mg/mL；甘草酸的回归方程为y=4651.9x+23.476，R2= 0.999 7，线性范围为0.012 49~0.099 93 mg/mL。甘草苷和甘草酸在各自范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验 取同一混合对照品溶液，进样测定6次，甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值分别为0.67%、0.43%，表明精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液置于室温，在0、2、4、8、12、24 h 时进样测定，甘草苷、甘草酸峰面积的RSD 值分别为1.26%、0.48%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.9 重现性试验 取批号211102 样品，平行制备6份供试品，进样测定，计算得RSD 值分别为1.45%、1.06%（n=6），说明该方法的重现性良好。

2.2.10 加样回收试验 平行称取批号为211102 的样品6 份，每份约2 g，计算甘草苷、甘草酸的含量。再分别加入约等量的对照品，按“2.2.3”项下方法制备测定，记录各样品中甘草苷、甘草酸的峰面积，计算回收率，结果见表1。甘草苷的平均回收率为99.01%，RSD =1.53%；甘草酸的平均回收率为99.26%，RSD=0.93%。RSD 均小于2%，表明该方法回收率良好。

表1 加样回收率试验结果Table 1 Result of recovery test

2.2.11 样品含量测定 取不同批次元和正胃片3 份（批号分别为210804、211102、211206），按“2.2.3”方法处理后测定，计算甘草苷、甘草酸含量。3 批次样品中甘草苷的含量依次为0.054 2 mg/片、0.053 5 mg/片、0.055 4 mg/片，RSD 为1.77%；甘草酸的含量依次为0.293 1 mg/片、0.297 mg/片、0.288 9 mg/片，RSD 为1.38%。表明不同批次的元和正胃片中甘草苷、甘草酸含量基本一致，均一性良好。根据上述结果，将标准定为测定值的80%，暂定元和正胃片中甘草苷的含量标准为≥0.04 mg/片，甘草酸的含量标准为≥0.24 mg/片。

3 讨论

本研究建立了元和正胃片中甘草的TLC 鉴别和甘草苷、甘草酸含量测定的方法，可以更好地控制其质量。在甘草的TLC 鉴别中，采用Gf 254 硅胶板，并以正丁醇-水-乙酸的上层溶液为展开剂，在该条件下，样品只需超声离心即可，无需药典中多次萃取与洗涤步骤，方便高效，且图谱斑点清晰，可为含甘草制剂的薄层鉴别提供参考。

甘草酸有一对异构体，即18 -和18 -甘草酸[10-12]，含量测定时一般以甘草酸铵作为对照品，根据分子质量（甘草酸质量=甘草酸铵质量0.979 7）换算甘草酸含量[13-15]。本研究也选用甘草酸铵对照品，选择2020版药典方法中的237 nm 作为检测波长。在试验过程中，比较了乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.05%磷酸两个酸性流动相体系，发现二者效果基本无差别，为减小对色谱柱的损伤，最终选用乙腈-0.05%磷酸作为流动相。元和正胃片处方中药材较多，成分复杂，杂质干扰较大，采用药典的梯度无法将甘草苷和甘草酸的峰与其他成分分离。通过调整流动相的比例，延长出峰时间，并进行梯度洗脱，使甘草苷和甘草酸的峰落在基线上，且分离度良好。对其进行方法学验证，满足含量测定的要求，可用于元和正胃片的质量标准控制。