泛癌中FGFR3表达的预后意义及其免疫调节作用*

许怡冉，何玥，李冕，鲁艳芹,3

（1.山东第一医科大学 临床与基础医学院，山东 济南 250117；2.山东第一医科大学 生物医学科学学院，山东 济南 250117；3.山东第一医科大学第一附属医院 内分泌科，山东 济南 250014 ）

FGFR3 基因属于受体酪氨酸激酶（FGFR）家族，位于人类染色体4p16.3，长约16.5 kb，是一种具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体。与配体结合后形成二聚体激活胞内酪氨酸激酶，在细胞内引起一系列级联反应，导致DNA 合成和细胞分裂［1］，并进一步激活下游MAPK 及PI3K/AKT 信号通路。其中细胞内MAPK 信号通路与肿瘤细胞增殖、迁移和转移行为相关；PI3K/AKT 信号通路与肿瘤细胞迁移、黏附及肿瘤血管的生成相关［2］。FGFR3 突变多发生在细胞外结构域（R248C,S249C），突变产生的新半胱氨酸残基可与受体二聚体共价结合，导致受体的结构性激活来参与肿瘤的发生。研究表明，约有35%膀胱癌及25%宫颈癌病例中发生了FGFR3 的基因突变，突变主要发生在浅表或乳头状低级别膀胱癌中，与良好的预后及临床分期相关［3-5］。基于大量的文献检索与临床数据，目前仍缺乏FGFR3 与各种肿瘤关系的泛癌证据。该研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中数据［6-8］分析基因表达、生存预后、免疫微环境和相关蛋白通路的分子特征，研究FGFR3 基因在不同肿瘤发病机制中临床预后及免疫相关性，为探讨潜在的肿瘤免疫治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 基因表达分析

利用TIMER2［9］数据库（http：//timer.cistrome.org//）中“Gene-DE”模块分析FGFR3 在正常组织与肿瘤组织间表达差异，评估FGFR3 具有治疗靶标的潜力。对于缺乏正常组织对比数据的肿瘤，利用GEPIA2［10］数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/index.html#index）的“Expression Analysis”模块分析，设置“P值=0.01，log2FC=1”，获得这些肿瘤组织与GTEx 数据库中对应的差异数据。通过GEPIA2 网站的“Stage Plot”模块分析多种不同病理分期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期）肿瘤组织中FGFR3 基因表达，用log2（TPM+1）转换后的数据作出“小提琴图谱”。

1.2 生存预后分析

利用GEPIA2“Survival Analysis”模块获得TCGA肿瘤中包含FGFR3 基因的肿瘤总体生存率（overall survival,OS）和无病生存率（disease free survival,DFS）数据图谱，设置表达参数“cutoff-hight（50%），cutoff-low（50%）”区分高表达组和低表达组。假设检验采用Mentel-Cox 检验，通过GEPIA2 的“Survival Analysis”模块绘制单基因生存分析图（Kaplan-Meier）。

1.3 基因变异分析

利 用 cBioPortal［11］数据库（https：//www.cbioportal.org/）中“Quick Search”模 块，选择TCGA 泛癌图谱分析，输入FGFR3 进行泛癌基因突变汇总，并在“Mutation”模块查询FGFR3 的基因突变频率，突变类型，拷贝数改变（CAN）、突变位点及蛋白质三维结构。利用“Comparison/Survival”模块获得FGFR3 基因在突变及未突变时，TCGA 肿瘤病例中无疾病的、无进展的和无疾病生存差异的总体数据，同时生成P值为log-rank的Kaplan-Meier 图。利用Rstudio 中TCGAbiolinks软件包下载突变注释文件，利用Spearman 相关性检验评估FGFR3 表达与TMB、MSI 间的相关性，使用配对t检验进行基因共表达分析。

1.4 免疫浸润分析

TIMER2 提供六种常见免疫细胞的渗透评分，包括B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞。利用Immune 模块分析TCGA 肿瘤中FGFR3 表达与免疫浸润之间的关系，采用XCell、MCPCOUNTER 和EPIC 算法进行免疫浸润评估。肿瘤纯度是本分析中的主要混杂因素［12］，通过纯度调整后的Spearman's 等级相关检验得到P值及偏相关系数（partial correlation,COR）值。数据以热图及散点图的形式展现。

1.5 FGFR3 相关基因的富集分析

通过 GEPIA2 数据库的“Similar Gene Detection”模块，得到与FGFR3 表达相关的前100 个靶向基因，应用log2TPM 方块图，得到P值和相关系数R，利用以上数据制作所选基因与FGFR3 的相关性热图。STRING 数据库是一个检索已知蛋白及预测蛋白间相互作用的数据库［13］（https：//string-db.org/），通过“Protein by name”模块，输入蛋白名称“FGFR3”，随后设置以下参数：最低交互分数设置为低信度0.150；最大交互对象数量设置为不超过50 个；来源设置为实验。筛选出50 个经实验验证的FGFR3 结合蛋白。使用Venn［14］网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将相关性前100 基因与蛋白互作的50 个基因进行交叉分析。结合两组数据进KEGG 和GO 通路分析。将基因列表上传到David网 站［15］（https：//david.ncifcrf.gov/）并选择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”和“Homo Spaiens”分别作为基因标识符和物种，使用cnetlot 函数（Circle=F,ColorEdge=T,Node_Label=T），对生物学过程的分子功能（molecular function,MF）数据通过ggplot2 和ForestPlot 的R 包生成cnet 曲线图［16］。其中，双侧P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因表达分析

在本研究中，笔者探讨人类FGFR3 基因（mRNA：NM_000142.5，蛋白质 ：NP_001341738.1）的致癌作用。系统发育树分析FGFR3 蛋白在不同物种间的进化关系，筛选出相似度最高的14 个物种进行同源分析，发现智人与黑猩猩，白颊长臂猿关系最近。

采用TIMER2 数据库分析TCGA 中FGFR3 mRNA 表达水平。在乳腺浸润癌（BRCA）、胆管癌（CHOL）、肝细胞肝癌（LIHC）、肺鳞癌（LUSC）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、甲状腺癌（THCA）组织中FGFR3mRNA 表达水平明显高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.001）。在结肠癌（COAD）、肾嫌色细胞癌（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肺腺癌（LUAD）组织中FGFR3mRNA 表达水平明显低于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.001），见图1A。

图1 FGFR3 基因在不同肿瘤和病理分期中的表达水平

将TCGA 与GTEx 数据库联合分析，补充GTEx 数据集的正常组织作为对照，进一步分析FGFR3 在卵巢浆液性囊腺癌（OV）、胸腺癌（THYM）、子宫肉瘤（UCS）、急性髓细胞样白血病、（LGG）、睾丸癌（TGCT）的正常组织和肿瘤组织中的表达差异（P＜0.01），见图1B。对于肾上腺皮质癌（ACC）、弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBC）和肉瘤（SARC）差异无统计学意义（P＞0.05）。

使用GEPIA2 中“Pathological Stage Plot”模块观察肿瘤中FGFR3 表达与临床分期间相关性，包括膀胱尿路上皮癌（BLCA）、肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肺腺癌、皮肤黑色素瘤和子宫内膜癌（UCEC），发现上述肿瘤中FGFR3 表达普遍呈上升趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1C。

2.2 生存预后分析

根据FGFR3 表达水平，将肿瘤划分为高表达组和低表达组。如图2A 所示，FGFR3 高表达与肾透明细胞癌（P=0.014）总体预后不良有关，低表达的FGFR3 与肾上腺皮质癌（P=0.012）和LGG（P=0.034）总体预后不良有关。无病生存率分析数据显示FGFR3 的高表达与头颈鳞状细胞癌（HNSC）（P=0.0067）患者预后差有关，低表达的FGFR3 与肾上腺皮质癌（P=0.015）、葡萄膜黑色素瘤（UVM）（P=0.0067）患者预后差有关（见图2B）。上述结果表明FGFR3 的表达高低与不同类型肿瘤的预后存在差异。

图2 FGFR3 基因与肿瘤生存预后的关系

2.3 基因突变分析

以FGFR3 突变为主要类型的膀胱尿路上皮癌患者，FGFR3 基因的变异频率最高（＞18.73%），子宫肉瘤以FGFR3 扩增为主，其变异频率＞15.79%，FGFR3 扩增是肾上腺皮质癌和胆管癌患者的唯一变异类型，其变异频率＞2%（见图3A）。进一步显示FGFR3 基因变异的类型和位点（见图3B），发现FGFR3 错义突变是遗传变异的主要类型，在1 例KRPCC、4 例LSCC、4 例头颈鳞状细胞癌、32 例LUCC 病例中检测出I-set 结构域中使FGFR3基因249 号位点发生拼接突变（见图3C）。

图3 TCGA 肿瘤中FGFR3 基因突变特征及基因共表达分析

评估FGFR3 表达与不同肿瘤类型的TMB 之间的关系，发现FGFR3 表达与膀胱尿路上皮癌、宫颈鳞癌和腺癌（CESC）、结肠癌、食管癌（ESCA）、头颈鳞状细胞癌、肾乳头状细胞癌、肺腺癌、间皮瘤（MESO）、皮肤黑色素瘤、胸腺癌中的TMB 相关，而与其他肿瘤无显著相关（见图3D）。此外，评估了不同肿瘤中FGFR3 表达与MSI 状态之间的关系，发现FGFR3 表达与肺腺癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌（PAAD）、前列腺癌（PRAD）、直肠腺癌（READ）、子宫内膜癌、葡萄膜黑色素瘤、结肠癌、肾透明细胞癌中的MSI 相关，而与其他肿瘤无明显相关性（见图3E）。

2.4 免疫浸润分析

使用不同算法研究免疫细胞浸润水平与FGFR3 表达间的相关性。基于全部结肠癌、头颈鳞状细胞癌、胰腺癌、前列腺癌和睾丸癌各肿瘤中FGFR 的表达与肿瘤相关成纤维细胞的浸润水平呈负相关，FGFR3 表达与卵巢浆液性囊腺癌相关成纤维细胞呈正相关（图4A）。在此，将上述肿瘤其中一种算法产生的相关性散点图作为代表展现（图4B,Rho=-0.391,P=1.00e-06）。

图4 FGFR3 基因表达与癌相关成纤维细胞免疫浸润分析

2.5 FGFR3 相关基因的富集分析

为了进一步研究FGFR3 基因在肿瘤发生中的分子机制，筛选出FGFR3 靶向结合蛋白及FGFR3表达相关基因进行一系列富集分析。采用STRING数据库，得到50 个基于实验数据支持的FGFR3结合蛋白。图5A 为这些蛋白相互作用网络。使用GEPIA2 工具结合TCGA 肿瘤的表达数据，得到FGFR3 表达相关的前100 个基因。图5C 所示，FGFR3 表达水平与ARHGAP23（R=0.33）、LET（R=0.31）、PVRL1（R=0.34）、SDC1（R=0.32）和TACC3（R=0.4）基因的表达水平呈正相关（P＜0.001）。相应热图数据显示FGFR3 在不同肿瘤中的表达差异性（图5D）。将蛋白互作的50 个基因与相关性前100 基因取交叉分析筛选出共同基因PVRL1（图5B）。

结合上述两组数据集进行KEGG 和GO 富集分析。KEGG 数据表明，FGFR3 在肿瘤发病机制中的作用可能与肿瘤信号通路（pathways in cancer）、MAPK 信号通 路（MAPK signaling pathway）和 PI3K-Akt 信号通 路（PI3K-Akt signaling pathway）有关（图5E）。GO 富集分析进一步表明，这些基因大多数与细胞增殖、分化及血管形成途径密切相关（图5F）。

3 讨论

通过文献检索，笔者没有检索到任何从整体角度对FGFR3 进行泛癌分析的文献。本文首次系统地通过生信分析发现FGFR3 在肝癌、睾丸癌等肿瘤组织中高表达，在肺腺癌、结肠癌、子宫肉瘤等组织中低表达。FGFR3 基因在肝癌中高表达，且其高表达和肝癌的恶性程度密切相关［17］。数据显示，肝癌是全球第五大癌症相关死亡原因，在我国其死亡率位居恶性肿瘤第2 位。全球每年新发肝癌病例85.4 万例，中国46.6 万例，约占全球的55%［18］，因而研究与开发肝癌特异性靶点药物在我国更加具有重要的意义。FGFR3 通过自分泌或旁分泌机制促进肝癌细胞的生长，但肝癌中信号通路间常存在广泛的交叉，FGF 信号通路联合其他途径将是今后研究的重要方向［19］。睾丸癌是一种多发于青壮年男性的恶性泌尿系统肿瘤，近年来其发病呈上升的趋势［20］。生信研究显示FGFR3 在睾丸癌中表达显著高于正常组织，其高表达与睾丸癌患者预后不良有关。FGFR3 信号在婴儿期和青春期前的精原细胞中活跃，并与磷酸化受体向细胞核的移位有关，FGFR3 信号促进精原细胞存活和增殖，在激活该途径突变的情况下导致睾丸癌的发生［21］。由于睾丸肿瘤比较少见，占泌尿系统肿瘤的5%［20］，在临床上关于睾丸癌的研究鲜有报道，睾丸癌在诊断、治疗、预后等方面缺乏敏感性与特异性的理想肿瘤标志物，因此，利用生物信息学手段，寻找特异性较高的睾丸癌标志物具有重要的临床意义，FGFR3 可能成为睾丸癌新的预后标志物及诊疗的潜在靶点。已有文献证实，FGFR3 基因是肺癌细胞转移的重要标志物，FGFR3 基因通过参与RAS/RAF/MEK/MAPK途径及促进上皮间质转化而促进肺癌的转移［22］。中国每年预计新增肺癌病例约70 万，新增肺癌死亡病例约40 万［23］。近期研究表明FGFR3 基因沉

默介导的基质金属蛋白酶9 下调可明显抑制肺癌细胞A549 的侵袭能力［24］。生信分析发现FGFR3高表达与肺癌患者OS、PPS、FP 预后不良有关，表明FGFR3 可能成为肺癌新的诊疗靶点和有效分子预后标志物。FGFR3 在结肠癌中低表达，是重要的肿瘤负调节因子。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，调查显示2021 年结肠癌为全球癌症死亡的主要原因［25］。研究表明FGFR3 表达抑制了结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，通过阻断FGFR3-IIIc 信号传导促进了结肠癌细胞凋亡［26］。表明FGFR3 有望成为治疗结肠癌的潜在靶点，可能是结肠癌预后的重要分子标志物。

恶性肿瘤的最大标志是不受控制的细胞增殖，酪氨酸激酶在增殖信号的转导上有重要作用，当它由于体内突变使得调节异常时，可以促进肿瘤的发生。以往人们对FGFR3 突变的研究主要围绕骨发育相关的人类遗传病，如FGFR3 特殊位点突变导致软骨发育不良［27］。近年来国外研究表明，FGFR 作为酪氨酸家族的一员，证实与肿瘤的发展密切相关［28］，尤其在膀胱癌中。生信分析观察到，FGFR3 最主要的变异类型是错义突变，在膀胱尿路上皮癌中突变频率最高（＞18.73%），FGFR3 的表达与膀胱尿路上皮癌患者的肿瘤突变负荷具有相关性，并且与大多数免疫点基因呈负相关。膀胱癌是发病率较高的癌症类型［29］，已有实验证实，FGFR3 突变与膀胱癌预后差有关［30］，FGFR3 突变能预测肌层浸润性膀胱癌术前新辅助化疗的疗效［31］，说明FGFR3 是膀胱癌重要的治疗和预后分析辅助标志物。分析发现FGFR3 在子宫肉瘤中的变异频率同样较高（＞15.79%），FGFR3 在子宫肉瘤中低表达，并且其扩增与子宫肉瘤预后差有关。子宫肉瘤是一类恶性间叶组织源性肿瘤，预后较差［32］，研究证实，RB1、TP53 和PTEN 是子宫肉瘤的重要分子标记物，子宫平滑肌肉瘤患者中TP53 突变的频率为24%～30%，PTEN 突变的频率为42%～58%［33］。因此FGFR3 也可能成为子宫肉瘤的新的诊断和预后分子标志物，这需要在前瞻性的临床试验中加以评估。

阻断免疫检查点途径是肿瘤免疫的有效措施，分析发现，在膀胱尿路上皮癌、结肠癌和睾丸癌中FGFR3 高表达与绝大部分检查点基因表达水平呈显著负相关，表明FGFR3 可能参与多种肿瘤的免疫调节。这些检查点基因的上调可能与FGFR3诱导MAPK/ERK 通路，引起的免疫细胞分化和极化有关。在结肠癌、睾丸癌中FGFR3 表达与肿瘤相关成纤维细胞的免疫渗透水平呈负相关。因此，FGFR3 不仅是肿瘤潜在的预后预测因子，还可能是重要的肿瘤免疫调节因子。

综上所述，FGFR3 的靶向免疫治疗研究尚处于初级阶段，很多问题仍然存在，如某些突变使得酪氨酸激酶耐药性的出现及MAPK/ERK 信号网络的代偿性作用，均可使FGFR3 的分子靶向治疗出现阻碍。因此，以FGFR3 为靶向的肿瘤基因治疗在临床上的应用价值尚待探索。通过FGFR3 的泛癌分析，有助于从临床角度理解FGFR3 在肿瘤发生发展中的作用，为临床诊断治疗提供新的思路。