妥拉唑啉控制雏鸡实验性近视进展的有效性和安全性

陈思童 孙丽媛 王凯 赵明威

近视是一项重大的公共卫生问题，目前近视防控的药物主要为低浓度阿托品，而临床中并不是对所有患者适用且有效，因此，新型药物仍亟需开发。在以动物模型和人群为对象的近视研究中均存在视网膜、脉络膜的血流灌注量减少、脉络膜变薄[1]的现象，而这种变化被认为是引起眼底退行性变的原因之一[2-3]。脉络膜作为高度血管化的结构，由交感神经和副交感神经共同支配，副交感神经刺激产生的一氧化氮（Nitric oxide，NO）介导前部脉络膜血管舒张，而交感神经受到刺激后引起整个脉络膜的血管收缩[4]。妥拉唑啉是一种非选择性竞争性α-肾上腺素能受体拮抗剂，能够抑制交感神经兴奋，抑制平滑肌收缩，导致静脉容量增加。L-NAME（NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester）作为eNOS（Endothelial nitric oxide synthase）的抑制剂，能够抑制血管内皮中eNOS的活性，eNOS能够增加血管内皮中NO的合成从而舒张血管。因此本研究选用妥拉唑啉对雏鸡实验性近视模型进行干预，观察玻璃体腔注射妥拉唑啉对实验性近视的有效性和安全性，同时联合应用L-NAME观察NO是否参与妥拉唑啉在雏鸡实验性近视中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2021年3月选用的6日龄白莱航鸡购自北京勃林格殷格勒维通生物技术有限公司，饲养于500 lx环境照度下，并维持12 h/12 h光照/黑暗循环，提供充足的食物和水。实验前排除屈光介质混浊的个体，实验前和实验后记录每个个体的体质量。本研究遵循美国视觉和眼科研究协会（American Association for Vision and Ophthalmology Research，ARVO）规定的眼科研究动物使用规范，并得到北京大学人民医院机构动物护理和使用委员会的批准（批号：2018PHC059）。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模 用0.9%氯化钠溶液配置100 μmol/L妥拉唑啉（TargetMol Chemicals Inc，US）溶液、一氧化氮合酶（Nitric-oxide synthase，NOS）抑制剂L-NAME（上海碧云天生物技术有限公司）。

将所有雏鸡随机分为形觉剥夺模型27 只、离焦诱导模型34 只和非近视造模雏鸡16 只。从6 日龄起对雏鸡进行实验性近视造模，形觉剥夺性近视（Form-deprived myopia，FDM）雏鸡配戴遮盖片，离焦诱导性近视（Lens-induced myopia，LIM）雏鸡配戴-10 D PMMA镜片，造模的同一天开始进行连续6 d的玻璃体腔注射干预，所有实验只对右眼进行处理，对侧眼不进行造模和玻璃体腔注药操作。在形觉剥夺模型中，将雏鸡随机分为形觉剥夺对照组9只（FDM）、形觉剥夺后妥拉唑啉干预组9 只（FDM+T100）和形觉剥夺后妥拉唑啉联合L-NAME组9只（FDM+T100+L-NAME）；在离焦诱导模型中，同样将雏鸡随机分为离焦诱导对照组11 只（LIM）、离焦诱导后妥拉唑啉干预组15 只（LIM+T100）和离焦诱导后妥拉唑啉联合L-NAME组8只（LIM+T100+L-NAME）；在非近视造模雏鸡中，随机分为空白对照组8只（Blank）和单纯妥拉唑啉干预组8只（Blank+T100）。空白对照组、形觉剥夺对照组和离焦诱导对照组每日注射12.5 μL 0.9%氯化钠溶液，妥拉唑啉干预组每日注射100 μmol/L妥拉唑啉12.5 μL（1.25 nmol），妥拉唑啉联合L-NAME组每日注射12.5 μL的L-NAME和妥拉唑啉混合溶液（妥拉唑啉含量1.25 nmol）。

在诱导过程中，每天同一时段进行注射，连续6 d，全程给予异氟烷气体麻醉，用盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天制药株式会社）给予表面麻醉后，开睑器暴露眼睑，用30 G胰岛素针头在角膜后约2 mm处穿刺，再用33 G Hamilton微量注射器注射[5]，并于注射后和次日清晨涂抹泰利必妥眼膏（日本参天制药株式会社）。

1.2.2 生物参数测量 在诱导开始前（0 d）、诱导结束后（6 d）的同一时段测量雏鸡的体质量、屈光度、眼球生物参数。高频A超（25 MHz，EYESCAN-100，美国TECLAB公司）测量全程采用异氟烷气体麻醉，将雏鸡固定于自制固定板上，表面麻醉后，放置开睑器以暴露角膜（不压迫角膜）。使用带状光检影镜（苏州六六视觉眼科医疗器械股份公司）在50 cm工作距离对雏鸡进行检影，取2条主子午线的等效球镜度作为屈光度。

测量得到角膜前、角膜后、晶状体前、晶状体后、视网膜前、视网膜后、脉络膜后、巩膜后8 个表面的位置数据，将数据导出到MATLAB上采用自编程序进行标记后，根据文献中眼球各结构声速[6]进行换算，每次测量15次取其平均值，得到眼球各部分结构的长度。统计每次测量的玻璃体腔深度、脉络膜厚度和眼轴长度。对实验前后各生物参数的变化量（实验后-实验前）进行计算。

1.2.3 ERG检测 在治疗结束后对雏鸡进行过夜暗适应，次日在气体麻醉下进行视网膜电图（ERG）的暗适应3.0和明适应3.0测量。暗适应3.0（刺激强度3.00 cd·s·m-2，0.05 Hz）主要观察视杆、视锥细胞的混合反应及其连接的双极细胞的功能，明适应3.0（刺激强度3.00 cd·s·m-2，0.05 Hz）主要观察视杆细胞及其连接的双极细胞功能。

对雏鸡进行气体麻醉后，用开睑器撑开双眼，将参考电极、接地电极和角膜电极分别放置于雏鸡的颈部皮下、背部皮下和角膜，并用卡波姆凝胶（美国博士伦公司）保持角膜湿润。采用ERG RETIport记录系统（德国罗兰视觉电生理仪），每个数据取3次测量的平均值。协议改编自国际视觉临床电生理学会的指南[7]。

1.2.4 TUNEL试验 将雏鸡断头处死后，摘除眼球并去除后极部肌肉及筋膜组织，在FAS眼球固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司）中固定30 min。将眼球前段角膜、晶状体去除，保留后极部，4%多聚甲醛溶液固定1 h，梯度过糖脱水后用OCT包埋剂（日本樱花公司）包埋，进行眼球后极部内的冰冻切片及TUNEL染色，在荧光显微镜200倍下拍照，每张切片随机选取后极部中央位置不重叠的3个视野计数TUNEL染色的阳性细胞个数取平均值。每个处理组选取3个个体样本的切片进行统计分析。

1.3 统计学方法

实验研究。使用SPSS 23.0进行统计分析，各计量资料经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布后，数据以表示，给药前后差值的2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；非正态分布的数据采用M（Q1，Q3）表示，2组间比较用Mann-WhitneyU检验，多组间用Kruskal-Wallis检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

所有雏鸡基线数据包含体质量、屈光度、玻璃体腔深度、脉络膜厚度、眼轴，各组间差异无统计学意义（P＞0.05），实验结束时各组体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 妥拉唑啉对形觉剥夺模型的近视进展和脉络膜的影响

处理6d 后，FDM、FDM+T 100 和FDM+T100+L-NAME组的屈光度变化量分别为（-15.56±1.12）（-7.81±0.91）（-9.64±0.94）D，FDM组和FDM+T100 组之间的屈光度变化值差异有统计学意义（t=-16.16，P＜0.001），FDM+T100组与FDM+T100+L-NAME组之间差异也存在统计学意义（t=4.20，P=0.001）。

3 组玻璃体腔深度增长量分别为（0.93±0.04）（0.46±0.14）（0.57±0.11）mm，FDM 组和FDM+T 100 组差异有统计学意义（t=9.93，P＜0.001），而FDM+T100与FDM+T100+L-NAME组之间差异无统计学意义（t=-1.84，P=0.085）。

3组脉络膜厚度变化量分别为（-58.50±28.06）（-5.42±58.47）（-21.24±53.16）μm，FDM组与FDM+T100组之间差异存在统计学意义（t=-2.46，P=0.031），而FDM+T100组与FDM+T100+L-NAME组之间差异无统计学意义。

3 组眼轴增长量分别为（1.30±0.11）（0.73±0.08）（0.83±0.10）mm，FDM 组和FDM+T 100 组之间的差异存在统计学意义（t=12.41，P＜0.001），FDM+T100与FDM+T100+LNAME 组之间差异存在统计学意义（t=-2.33，P=0.033）。

2.3 妥拉唑啉对离焦诱导模型的近视进展和脉络膜的影响

处理6 d后，LIM、LIM+T100和LIM+T100+LNAME组的屈光度变化量分别为（-10.27±1.43）（-7.63±0.91）（-9.19±1.02）D。LIM 组和LIM+T100 组之间的屈光度变化值差异有统计学意义（t=-5.77，P＜0.001），LIM+T100 组与LIM+T100+L-NAME组之间差异也有统计学意义（t=3.74，P=0.001）。

3 组玻璃体腔深度增长量分别为（0.61±0.11）（0.45±0.09）（0.54±0.07）mm，LIM组和LIM+T100组差异有统计学意义（t=4.19，P＜0.001），LIM+T100组与LIM+T100+L-NAME组差异也有统计学意义（t=-2.93，P=0.008）。

3组脉络膜厚度变化量分别为（-23.26±38.46）（-8.75±53.49）（-23.51±39.45）μm，LIM与LIM+T100组、LIM+T100与LIM+T100+L-NAME组差异均无统计学意义（t=-0.77，P=0.452；t=1.23，P=0.233)。

3 组眼轴增长量分别为（0.90±0.10）（0.73±0.11）（0.82±0.04）mm，LIM组和LIM+T100组之间的差异存在统计学意义（t=4.19，P＜0.001），LIM+T100与LIM+T100+L-NAME组之间也存在显著性差异（t=-3.20，P=0.005）。

2.4 妥拉唑啉不影响眼球正常生长发育

Blank组和Blank+T100组间进行单因素方差分析显示，屈光度变化量分别为（-2.16±0.87）D和（-1.69±0.84）D，组间差异无统计学意义（t=-1.10，P=0.291），眼轴增长量分别为（0.59±0.10）mm和（0.58±0.10）mm，组间差异无统计学意义（t=0.94，P=0.788），说明单纯妥拉唑啉注射并没有抑制正常眼球的生理性生长。

Blank组及Blank+T100 组、FDM+T100 组、LIM+T100组都进行眼球切片和TUNEL染色（每组至少3只眼球），各组的TUNEL染色结果都罕见荧光着染的细胞，见图1。

图1.诱导6 d后各处理组雏鸡视网膜凋亡TUNEL染色结果A：阳性对照（用DNase I处理形成为凋亡细胞的DNA断裂形态）；B：阴性对照（无酶）；C：空白对照组（Blank）；D：单纯妥拉唑啉注射组（Blank+T100）；E：形觉剥夺后妥拉唑啉干预组（FDM+T100）；F：离焦诱导后妥拉唑啉干预组（LIM+T100）Figure 1.Results of TUNEL staining for retinal apoptosis in chicks of each treatment group after 6 days treatmentA: Positive control (DNase I treatment to mimic the DNA strand breakcharacteristic of apoptosis);B: Negative control (no enzyme);C: Blank group,only get vitreous injection of saline;D: Blank+T100 group,get vitreous injection of 100 μmol/L tolazoline;E: FDM+T100 group,goggled with diffusers and get vitreous injection of 100 μM tolazoline;F: LIM+T100 group,goggled with -10 D lens and get vitreous injection of 100 μmol/L tolazoline.FDM,form-deprived myopia;LIM,lens-induced myopia;T100,100 μmol/L tolazoline.GFP,green fluorescent protein;DAPI,4',6-diamidino-2-phenylindole;GCL,ganglion cells layer;INL,inner nuclear layer;ONL,outer nuclear layer.

2.5 ERG

暗适应3.0反映了视杆和视锥混合系统的功能，明适应3.0反应的是视锥系统的功能，a波反映的是视锥细胞的功能。为了减少由于麻醉和操作带来的个体差异，本研究对暗适应和明适应刺激反应的a波、b波的测量值，以右眼/左眼的比值进行统计学分析[8]，对Blank组和Blank+T100组进行对比显示，2组间各测量波的双眼比值差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1.空白对照组和单纯妥拉唑啉注射组的ERG双眼比值（右眼/左眼）Table 1 The ERG statistical ratio results of the blank group and the blank+T100 group (right/ left)

3 讨论

近年来，脉络膜作为近视防控的关键靶点，受到越来越多的关注。临床研究显示，随着近视进展，脉络膜呈现变薄趋势，中心凹下脉络膜厚度与屈光度和年龄的关系可通过多元回归得到脉络膜厚度=365.1-2×年龄+7.9×屈光不正[9]。近视儿童的脉络膜与非近视儿童相比显著变薄，而在早期近视发展中视网膜厚度不变或增厚，这意味着脉络膜厚度的变化可能先于视网膜变薄，发生在近视初期[10]。因此，早期近视防控应聚焦于脉络膜厚度变化。

脉络膜作为高度血管化的组织，不仅能为外层视网膜提供氧气和营养，通过调节脉络膜血流来调节眼内压，还能通过改变脉络膜厚度调整视网膜的位置，释放参与调节血管形成、巩膜重塑及眼睛生长调节的因子[11-14]。脉络膜厚度的改变主要取决于脉络膜血管直径改变引起的血流量变化[15]。近期研究表明，脉络膜的血流信号影响了巩膜的氧气和营养供应，进而造成近视中的巩膜缺氧和巩膜细胞外基质重塑，而红景天苷、芒柄花素等抗缺氧药物[16]能够通过抑制巩膜缺氧而控制近视。本研究中选用的妥拉唑啉是一种非选择性α肾上腺素受体阻滞剂，能抑制交感神经兴奋和平滑肌收缩，对α1、α2肾上腺素受体有拮抗作用，同时具有舒张血管的作用[17-18]。在安全性实验中，不论是非近视模型中单纯妥拉唑啉注射组，还是形觉剥夺或离焦诱导模型中的妥拉唑啉注射组，都没有使雏鸡视网膜的各层细胞发生凋亡；同时，单纯妥拉唑啉干预组对于视网膜视锥细胞和视杆细胞以及与它们相连的双极细胞的功能都没有显著性的损害，说明妥拉唑啉在雏鸡中玻璃体腔注射安全性良好，妥拉唑啉并没有因为药物或剂量的毒性抑制眼球正常发育而显示出对雏鸡屈光度和眼轴增长的控制效果。

本研究同时构建了离焦诱导模型和形觉剥夺模型。既往研究表明，这两类近视的致病机制并不完全相同，这种差异可能是由视网膜如何响应不同的光学干预而影响近视生长造成的[19]。FDM中只要保持持续的形觉剥夺，并且处于发育可塑期，就会导致眼部生长速率增加；相反，LIM中，当眼轴生长到与施加的离焦量相抵消时，眼睛生长就会停止。并且，FDM和LIM动物模型的脉络膜厚度对2种刺激的反应也不同，LIM雏鸡的脉络膜变薄现象相对正常眼并不显著，而FDM雏鸡脉络膜显著变薄[20]。同时，近视相关的生长调节因子DA、乙酰胆碱在FDM和LIM作用通路中受体的主导地位也不全相同[19]，例如多巴胺D2 受体拮抗剂能够抑制FDM形觉恢复期的正视化和脉络膜增厚，但对于LIM并无影响[21]。在本实验中，虽然妥拉唑啉对FDM和LIM都能有效抑制其屈光度和眼轴的近视化进展，但对FDM的屈光度和眼轴控制效果为57.8%和80.3%，而对LIM的屈光度和眼轴控制效果只有32.6%和54.8%，并且妥拉唑啉能显著抑制FDM中的脉络膜变薄现象，而在LIM中脉络膜变薄只表现出微弱的抑制趋势。这说明妥拉唑啉可能在LIM模型和FDM模型中的作用通路并不完全相同，妥拉唑啉可能在FDM模型中发挥了更强的扩张血管和脉络膜增厚效应。但由于脉络膜厚度与眼轴长度呈负相关[22-23]，因此妥拉唑啉只能够延缓其变薄趋势，却不能使脉络膜增厚。在雏鸡预实验中，对不作任何处理的8只眼和单纯注射0.9%氯化钠溶液的8 只眼的脉络膜厚度进行统计分析，2组间差异不存在统计学意义，说明在雏鸡正常生长中可能存在脉络膜的生理性变薄；本研究中对照组单纯注射0.9%氯化钠溶液与单纯注射妥拉唑啉组，随着眼轴和屈光度的生长，也呈现脉络膜变薄的趋势，这与人类儿童成长中脉络膜厚度增加不同，可能是由于雏鸡脉络膜的昼夜节律较人类更为显著[24]，而在眼底不同区域的脉络膜厚度也有所差异，因此需要进一步实验验证脉络膜的血流灌注量来量化脉络膜在近视防控中的效果。

目前近视的发病机制和防控机制研究仍未明晰，但已有多项研究证实可以通过干预肾上腺素通路发挥近视防控效果。由于多巴胺（Dopamine，DA）与去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）共同作用于G-蛋白偶联受体（GPCR），存在竞争性拮抗关系，有研究认为阿托品[25]可能是通过阻断α2 肾上腺素能受体，而不是毒蕈碱受体（mAChR）来抑制近视。Mathis等[26]的研究显示毒蕈碱受体和肾上腺素α2受体共同在视网膜多巴胺能神经元上表达，α2A受体激动剂抑制了治疗眼和对侧眼的DA释放，而α2A受体拮抗剂和阿托品均能刺激DA的释放。但另一项研究[27]认为，α2 肾上腺素受体激动剂（20 nmol和200 nmol的溴莫尼定和胍法辛）能够抑制FDM雏鸡的近视进展，可能是通过α2A受体和DA共同介导，调节了酪氨酸羟化酶的活性，但此项实验并没有排除近视控制现象是否是由于药物浓度过高或药物本身造成了毒性效应抑制了眼球正常生长。因此，妥拉唑啉的潜在作用机制除了抑制α1A受体来扩张血管，同时有NO共同参与调控脉络膜血管扩张，也可能通过抑制α2A受体来刺激DA释放，来共同抑制近视的进展，具体作用机制有待进一步验证。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明陈思童：设计实验，实施研究，收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。孙丽媛：实施研究，收集数据，参与修改论文的结果结论。王凯、赵明威：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果结论，根据编辑部的修改意见进行核修