紫梗籽银桂种胚发育与胚乳营养物质的变化研究

朱永莉, 沈永宝

(1.南京林业大学风景园林学院, 南京 210037; 2.上海商学院艺术设计学院, 上海 201400;3.南京林业大学林学院, 南京 210037; 4.国家林业和草原局南方林木种子检验中心, 南京 210037;5.南京林业大学,南方现代林业协同创新中心, 南京 210037)

高等植物种子发育通常可分为形态发育阶段(胚、胚乳和种皮发育)和种子成熟阶段(胚根的生长和种子灌浆),其中后者是种子发育的重要阶段,碳水化合物、脂质和蛋白质等贮藏物质的动态变化对种子的质量具有重要的意义[1-3]。植物种子发育过程需要可溶性糖、淀粉、蛋白质等营养物质以保证种子与胚的正常发育[4-9],因此研究种胚发育过程中内含物质的变化规律有利于了解种子的成熟过程和发育机理。桂花(Osmanthusfragrans)为木犀科木犀属常绿木本植物,是我国传统十大名花之一,桂花树姿优美,香味浓郁,具有很高的园林观赏价值,现广泛栽培于北亚热带和中亚热带地区[10]。近年来,有关桂花资源分布[11]、品种分类[10,12]、开花及传粉生物学[13-14]、胚胎学[15-16]、保护遗传学[17-18]、繁殖生物学[19-20]及种子休眠[21-22]等方面的研究较多,而与桂花种子的发育生物学相关的研究略显薄弱。另外,桂花秋季(9—10月)开花,次年4—5月种子成熟,种子发育时间长,且结实率低导致取材难度较大,限制了桂花种子的发育生物学研究。为深入了解桂花种胚发育过程及成熟机制,本研究以发育不同时期的紫梗籽银桂种子为研究对象,观察种胚形态发育过程,分析发育过程中可溶性糖、淀粉、蛋白质和粗脂肪等营养物质含量变化,揭示其种子发育过程中生理特性和重要指标的变化规律,探讨桂花种胚发育成熟的机制,为探明桂花种胚发育生理过程及其分子作用机理奠定基础,以期为桂花实生苗木培育、种质资源保存提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验材料为紫梗籽银桂(O.fragrans‘Zigengziyin’),试验所用的种子采于南京市八卦洲街道院内,于花后60 d开始,至来年果实成熟,每隔15～20 d进行取样,共取样11次。紫梗籽银桂花期9—10月,果实成熟次年4—5月,花后180 d,种胚开始大量形成。采集的材料用冰盒带回实验室后立即去除果皮取出种子,一部分用于测定种子大小、含水量等变化,观察种胚形态建成,另一部分分别剥离胚和胚乳,放入-76 ℃超低温冰箱保存用于可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、粗脂肪等组分测定。

1.2 研究方法

1.2.1种实生物学特性研究

随机选取30粒不同发育阶段的果实,用体式显微镜观察各个时期的种子及种胚的发育状况;用游标卡尺测量果实的纵径和横径,精确到0.001 cm。随机取5 g左右果实,用美国LI-COR公司生产的LI-6400光合仪测定果实的呼吸强度,依据GB 2772—1999《林木种子检验规程》,采用烘箱恒温干燥法测定果实含水量。

1.2.2胚乳营养物质的测定

可溶性糖含量[23]、淀粉含量[24]测定采用蒽酮比色法,可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[23],粗脂肪含量测定采用索氏提取法[23]。

1.3 数据分析

运用 Excel 2013软件对数据进行分析处理和图表制作,采用SPSS 20.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 种实生物学特性

2.1.1果实形态变化

紫梗籽银桂果实由外至内依次为外果皮、中果皮(果肉)和内果皮(种壳)及种子。从花后60 d到花后120 d,外果皮和中果皮(果肉)部分均为绿色,种实含水量较高,胚乳呈胶状液体,内果皮的木质化程度逐渐加深(图1 a～图1 d)。花后135 d,胚乳逐渐变浓稠,边缘部分出现白色固体状物质(图1 e);花后150 d,种胚开始形成(图1 f);至花后165 d,胚体开始出现,胚乳成为白色固体状态(图1 g);花后180 d开始,种胚大量形成(图1 h～图1 i);花后195 d,果皮变为紫色,果肉变软,易于剥离,种壳进一步木质化,变厚变硬,胚乳变为白色固体状态,胚逐渐占满胚腔,种子发育趋于成熟,此后紫梗籽银桂的种实在形态上未有太大变化(图1 j);花后210～225 d,果实进一步发育成熟,果皮变为紫黑色,胚完成形态后熟占满整个胚腔,子叶、胚轴、胚根清晰可见,种壳靠近胚根处发芽孔开裂,种子发育成熟(图1 k～图1 l)。

注:a～l为紫梗籽银桂果实不同时期纵剖面(20×)。

2.1.2果实大小变化

紫梗籽银桂果实的大小在发育过程中基本呈持续上升的趋势,纵径从花后60 d的0.652 cm到花后225 d(果实成熟)时增加到1.581 cm,横径从0.249 cm增加到0.707 cm,分别增长了0.929 cm和0.458 cm(图2)。

图2 紫梗籽银桂发育过程中果实大小变化

2.1.3胚的变化

紫梗籽银桂种子发育过程中种胚的比率和种胚长度变化如图3、图4所示,其胚的发育大约经历三个阶段:花后150～165 d为种胚开始形成期,胚体可见,种胚的平均长度约为0.137 cm;花后165～195 d为种胚快速形成期,该阶段胚的长度升至0.628 cm,胚形成率由花后180 d的15%上升至花后195 d的53%;花后195～225 d为种胚成熟期:该阶段胚的长度上升至0.928 cm,种胚形成率也上升至93%。

图3 紫梗籽银桂种子发育过程中种胚形成的比率变化

图4 紫梗籽银桂种子发育过程中种胚的长度变化

2.1.4果实呼吸速率变化

如图5所示,紫梗籽银桂果实发育过程中呼吸速率整体呈下降趋势。花后60 d到花后80 d, 呼吸速率从47.556 μmol/(g·min)下降到33.582 μmol/(g·min),这期间果实中含水量增长较快,种壳内主要呈液体状胶状物,呼吸速率下降;花后80～120 d,呼吸速率从33.582 μmol/(g·min)上升到44.319 μmol/(g·min),果实呼吸速率上升并趋于稳定,花后120 d后再下降,直到花后180 d呼吸速率下降至29.403 μmol/(g·min),花后195 d下降到15.584 μmol/(g·min),这可能是由于花后80～120 d果实的发育较旺盛,细胞分裂活跃,需要较多的物质和能量,呼吸作用较强;从花后120 d之后随着果实的发育,各项组织逐渐成熟,呼吸速率逐渐降低,花后180 d种胚大量形成,种壳(内果皮)趋于木质化,种子发育趋于成熟,呼吸速率急剧下降;花后195～225 d,随着果实和种子的发育,胚进一步长大完成形态后熟占满胚腔,外果皮和中果皮随着种子和果实的发育成熟逐渐软化解体,呼吸作用有所增强,呼吸速率上升,从15.584 μmol/(g·min)上升到19.833 μmol/(g·min),基本趋于稳定。这与之前的细胞学解剖结构观察基本一致。

图5 紫梗籽银桂果实发育过程中呼吸速率和含水量变化

2.1.5果实含水量变化

紫梗籽银桂果实发育过程中含水量呈先升后降趋势。花后60～165 d,随着果实由小到大发育,果实的含水量呈上升趋势,由71.10%上升到82.49%,此阶段果实中各种组织尚未发育成熟,果实中含水量较高。随着果实的发育,胚乳内营养物质不断积累,胚不断成熟,果实含水量逐渐下降,至花后225 d果实发育成熟,含水量为72.75%,后趋于稳定(图5)。

2.2 胚乳营养物质的变化

2.2.1可溶性糖含量变化

随着紫梗籽银桂种子的发育,胚乳内可溶性糖含量总体呈上升的趋势。花后80 d胚乳中可溶性糖含量0.52%,花后150 d上升到0.79%,之后出现略微下降,花后165 d,可溶性糖含量下降至0.63%,这可能是由于这一阶段胚开始形成,胚的发育消耗一定的糖,导致可溶性糖含量下降;花后180～195 d,随着种子的进一步发育,胚乳由胶状液态变为白色固态,胚乳中营养物质积累加速,可溶性糖含量上升幅度较大,由0.64%上升至1.04%,之后可溶性糖含量继续上升,至花后225 d上升至1.26%,种子发育成熟,为种子萌发储备物质和能量(图6)。

图6 紫梗籽银桂种子发育过程中可溶性糖含量变化

2.2.2淀粉含量变化

紫梗籽银桂种子在发育过程中淀粉含量呈先降后升的趋势。花后80～100 d,淀粉含量由21.6%上升至24.39%,之后逐渐下降,至花后150 d,下降至16.03%,这可能是在种子发育的前期,胚乳内淀粉逐渐被水解为可溶性糖供种子利用,这与该段时期内可溶性糖含量的变化相吻合;花后150 d开始,随着种胚的出现,淀粉含量逐渐上升,花后180～195 d上升幅度较大,由19.99%上升至40.3%,此时胚发育进一步成熟,逐渐占满胚腔,胚乳由胶状液态变为白色固态,胚乳中营养物质积累加速,淀粉含量升高,之后随着种子的发育成熟,淀粉含量上升至46.78%(花后210 d),之后略为下降,后趋于稳定(图7)。

图7 紫梗籽银桂种子发育过程中淀粉含量变化

图8 紫梗籽银桂种子发育过程中可溶性蛋白含量变化

2.2.3可溶性蛋白含量变化

紫梗籽银桂种子发育过程中可溶性蛋白含量前期变化比较平稳,后期呈上升趋势。花后80～165 d,可溶性蛋白含量较平稳,花后165 d开始逐渐上升,花后180～195 d可溶性蛋白含量的上升幅度较大,从8.15 mg/g升至24.51 mg/g,该段时期胚逐渐占满胚腔,胚乳由胶状液态变为白色固态,胚乳中营养物质积累加速,至花后210 d可溶性蛋白含量有所下降,可能是种胚发育进入后期,需要较多的蛋白质支持,到花后225 d种子成熟,可溶性蛋白含量有所恢复保持稳定,为种子萌发做好准备(图8)。

2.2.4粗脂肪含量变化

紫梗籽银桂种子发育过程中粗脂肪含量不断增加。花后80～165 d,增加比较缓慢,由8.83%增加至10.68%,花后180 d之后,上升幅度较快,粗脂肪含量由11.17%上升到18.67%,作为胚乳中的营养物质大量储存,为种子萌发做好准备(图9)。

图9 紫梗籽银桂种子发育过程中粗脂肪含量变化

3 讨 论

种子的成熟过程实质上就是胚从小长大,以及营养物质在种子中变化和积累的过程[25],包括化合物的积累、酶类及激素的调节与代谢等[26]。紫梗籽银桂种胚的发育大约经历三个阶段:种胚开始形成期、种胚快速形成期和种胚成熟期。种子各类营养物质快速积累发生在花后180 d之后,此期间种胚开始大量形成,到种子成熟阶段达到峰值。紫梗籽银桂果实在发育初期含水量较高,随着果实的发育成熟,胚乳内营养物质不断积累,果实含水量逐渐下降并趋于稳定,在此期间原生质也由溶胶状态转变为凝胶状态,种子的生命活动亦由代谢活跃转入休眠状态[27]。紫梗籽银桂果实在花后前165 d,果实的含水量呈现上升趋势。在花后165 d之后,胚开始出现,胚乳内营养物质不断积累,果实含水量逐渐下降,至果实成熟基本趋于稳定。这与紫花地丁Viola philippica[28]、牡丹Paeonia × suffruticosa[29]、黄莲木Pistacia chinensis[30]、无患子Sapindus Saponaria[31]等物种相一致。

可溶性糖、油脂和蛋白等可为种胚的生长发育提供必须的营养和能量,并在后期作为营养物质积累起来,为种子萌发提供能量[32]。紫梗籽银桂在花后前135 d为种子胚乳固态化的重要时期,胚乳逐渐变得浓稠,表明种子内的可溶性糖和淀粉等营养物质主要用于自身形态建成,可溶性糖、淀粉和脂肪积累较慢;在花后165～195 d,种子内部结构逐步构建完成,胚乳转化为白色固体状态,胚体逐步占满胚腔,种子发育趋于成熟,在此期间,可溶性糖、油脂和蛋白上升趋势明显,可溶性糖、淀粉和脂肪的迅速积累可为胚胎的正常发育提供必要的能量支持。

可溶性糖作为生命活动能量的源泉,不仅是植物胚生长发育营养物质和能量的重要来源[5],而且参与种子发育后期营养物质储存积累[32-33]。紫梗籽银桂种子在发育过程中,胚乳可溶性糖含量总体呈现上升的趋势(在胚建成初期略有回落),至果实成熟时达到最大(1.26%),高含量的可溶性糖为种子萌发提供物质和能量储备。紫梗籽银桂种胚形成过程中,在花后165 d胚形成后,可溶性糖含量迅速积累,这可能是该时期细胞处于旺盛的分裂和分化阶段,可溶性糖的快速积累可满足发育早期较高的能量支持。

紫梗籽银桂胚乳中淀粉含量在种子发育前期呈逐渐递增的变化趋势,在胚建成期(花后135～165 d)略有下降,此后又逐渐上升并趋于稳定,这可能是由于在种子发育的前期,胚乳内淀粉逐渐被水解为可溶性糖供种子利用,这与该段时期内可溶性糖含量的变化相吻合。总体上看,紫梗籽银桂种子的发育表现为淀粉沉积的过程,这与米槁Cinnamomum migao[34]、“凤丹”Paeonia ostii ‘Feng Dan’[9]等种子的发育结果基本相似。

蛋白质作为种子发育过程中氮源的重要来源之一,可为种子及胚胎发育奠定物质基础。紫梗籽银桂种子发育过程中可溶性蛋白含量前期变化比较平稳,后期呈现上升趋势,这与红松Pinus koraiensis[8]、短丝木犀Osmanthus serrulatu[35]、板栗Castanea mollissima[36]等种子发育过程中蛋白质含量变化趋势一致。由此可见,在紫梗籽银桂种胚后期的成熟过程中,需要有大量的蛋白质参与,为种胚的继续生长发育提供养分,并且蛋白质也作为种胚形态建成的结构组成物质发挥作用。

植物油脂的积累时期因物种的不同而存在差异[37],紫梗籽银桂在花后前150 d胚乳没有固化,脂肪含量增加缓慢,含量较低;在花后165 d之后,胚乳逐渐固化,脂肪含量逐渐增加,这一结果与文冠果Xanthoceras sorbifolium[38]、核桃Juglans regia[41]等物种的种子发育研究结果相似。有研究结果表明,可溶性糖会在油脂快速积累之前大量积累,但在油脂积累过程中却不断减少[39-42],即种子在发育过程中可溶性糖、蛋白等在积累的同时会被消耗,但本研究结果表明,紫梗籽银桂种子脂肪含量与可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉含量的变化趋势基本相似,这可能与这些物种的生物学特性和取样策略相关。