隐丹参酮调节Sirt1/FoxO1信号通路对高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤的影响

武文印, 武禹佳, 李 艳, 梁进颖

(1.河北省唐山市中医医院治未病科, 河北 唐山 063000 2.河北省唐山市丰润区人民医院, 河北 唐山 063000)

糖尿病肾病(DN)常见于糖尿病(DM)患者,约 30～40% 的DM患者会出现肾功能不全[1]。肾小球内皮细胞 (GEC) 是肾小球的固有细胞之一,作为肾小球滤过膜的第一道屏障,GECs与血液中的循环物质直接接触,更容易受到葡萄糖、脂质和炎症因子的破坏。DN 的特点是GEC损伤,GECs在DN的发生发展中起重要作用[2]。众所周知,高血糖是通过诱导GEC功能障碍而导致 DN 发病最重要的危险因素之一[3]。因此改善高糖诱导的GEC损伤对于 DN 的治疗很重要。隐丹参酮(cryptotanshinone,CT)是一种天然醌类化合物,Song等[4]发现,CT可促进 2 型糖尿病的伤口愈合,对炎症、血管生成和细胞外基质重塑具有调节作用。但是关于CT对DN的影响尚未见报道。沉默信息调节因子1(Sirt1)/叉头框蛋白O1(FoxO1)通路是重要的信号通路,被认为参与调节氧化应激、炎症反应和细胞凋亡 。Xu等[5]发现二甲双胍可通过激活Sirt1/FoxO1自噬信号轴减轻DM大鼠肾损伤。是否CT可以通过调控Sirt1/FoxO1信号轴改善高糖诱导的GEC损伤我们进行了研究,以期为DN的治疗提供数据参考。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂:人GEC(货号:ABC-TC3783)购自上海启达生物科技有限公司;CT(货号:YG11560)购自上海韵泰信息科技有限公司;Sirt1/FoxO1信号通路抑制剂SIRT1-IN-1(货号:HY-136199)购自MedChemExpress LLC;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(货号:BY-B10110)上海白益生物科技有限公司;白介素-6(IL-6)(货号:EKHU2643)、白介素-8( IL-8)(货号:EKHU2645)购自迪信泰检测科技(北京)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)(货号:JKSJ--1821)、丙二醛(MDA)(货号:JKSJ--1892)购自上海晶抗生物工程有限公司;MTT毒性和细胞活力试剂盒(货号:M1020)购自北京雅安达生物技术有限公司;抗体:p-Sirt1(货号:79-978)购自ProSci;Sirt1(货号:E11-8476B )购自EnoGene;p-FoxO1(货号:SAB4300094) 购自MilliporeSigma;FoxO1(货号:bs-3142R)购自 Bioss;程序性死亡受体-1(Beclin 1)(货号:3495)、微管相关蛋白轻链3(LC3)(货号:2775)、转化生长因子β1 (TGF-β1)(货号:3709 )、Bcl-2相关X蛋白(Bax)(货号:2772)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)(货号:9661)购自Cell Signaling Technology;Ⅰ型胶原(Col-I)(货号:ab6308)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)(货号:ab32124) 购自Abcam 。

1.2细胞毒性检测:通过MTT法检测CT的细胞毒性,将GEC接种在96孔板上(5×103个细胞/孔),培养24h后用不同浓度的CT(0、1、5、10、20、40μmoL/L)处理GEC 24h。然后每孔添加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,常温孵育4h后,加入100μL/孔二甲基亚砜,震荡后用酶标仪检测OD570值。

1.3细胞培养及分组:将GEC于DMEM培养基培养(10%FBS),并将培养基放在37℃,5%CO2常规培养箱,当细胞融合率到70%,用胰酶消化、传代培养。将GEC分为对照组(NR组,5mmoL/L D-葡萄糖)、高糖组(HG组,30mmoL/L D-葡萄糖)、L-CT组(1 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖处理GEC)、M-CT组(5 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖处理GEC)、H-CT组(10 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖处理GEC)和SIRT1-IN-1 组(10 μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖+0.05moL/L Sirt1/FoxO1信号通路抑制剂SIRT1-IN-1处理GEC),培养24h后,收集GEC。

1.4MTT法检测GEC增殖活性:取各组生长状况较好的GEC培养24h后,使用MTT法检测GEC细胞活性,操作步骤参考1.2。

1.5流式细胞术检测GEC凋亡:取各组GEC,经离心后用PBS冲洗,与500μL结合缓冲液混匀,然后加入5μL AnnexinV-FITC孵育15min,2.5μL PI染液孵育5min,最后,在1h内用流式细胞仪分析GEC凋亡率。

1.6ELISA法检测GEC培养上清液中炎性因子以及氧化应激指标水平:收集各组GEC培养液,置于4℃离心机以10000×g离心8min,分离上清液,参考ELISA试剂盒检测炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-8)水平,以及氧化应激指标(SOD、MDA)水平。

1.7Western blot法检测细胞中自噬、凋亡、纤维化因子和Sirt1/FoxO1通路相关蛋白表达:将RIPA裂解液与GEC混匀后提取总蛋白,通过BCA法测定蛋白浓度后用12% SDS-PAGE电泳分离蛋白质,转到PVDF膜上后用5%脱脂牛奶封闭1h,并与一抗Col-I (1∶1000)、TGF-β1(1∶1000)、Beclin-1(1∶500)、LC3(1∶500)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶500)、Cleaved Caspase-3(1∶500)、p-Sirt1(1∶1000)、Sirt1(1∶1000)、p-FoxO1(1∶500)、FoxO1(1∶1000)和GAPDH(1∶2,000),4℃下过夜。随后加入二抗,ECL染液使蛋白可视化,Image J软件使蛋白定量。

2 结 果

2.1CT对GEC毒性的影响:0～40μmoL/L CT对GEC无明显毒性影响(P>0.05)。见表1。

表1 CT对GEC的毒性作用

2.2CT对GEC增殖活力的影响:与NR组相比,HG组OD570值显著下降(P<0.05);与HG组相比,L-CT组、M-CT组、H-CT组OD570值显著增大(P<0.05);SIRT1-IN-1组较H-CT组OD570值显著减小(P<0.05),见表2。

表2 各组GEC的增殖活性比较

2.3CT对GEC凋亡水平的影响:与NR组相比,HG组GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著上调(P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著下调(P<0.05);与HG组相比,L-CT组、M-CT组、H-CT组GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05);SIRT1-IN-1组较H-CT组GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著上升(P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著下降(P<0.05),见图1-2,表3。

表3 CT对GEC凋亡率及凋亡相关蛋白的影响

图1 流式细胞术检测GEC凋亡

图2 Western blot 检测GEC凋亡相关蛋白

2.4CT对GEC培养上清液中炎性因子水平和氧化应激指标水平的影响:与NR组相比,HG组IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量显著上升(P<0.05),SOD含量显著下降(P<0.05);与HG组相比,L-CT组、M-CT组、H-CT组 IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量显著下降(P<0.05),SOD含量显著上升(P<0.05);SIRT1-IN-1 组较H-CT组IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量显著增加(P<0.05),SOD含量显著减少(P<0.05),见表4-5。

表4 CT对GEC炎性因子水平的影响

表5 CT对GEC氧化应激指标水平的影响

2.5CT对GEC自噬蛋白水平的影响:与NR组相比,HG组GEC Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平显著下调(P<0.05);与HG组相比,L-CT组、M-CT组、H-CT组 Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平显著上调(P<0.05);SIRT1-IN-1 组较H-CT组Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平下降(P<0.05),见图3,表6。

图3 Western blot检测GEC Beclin1 LC3蛋白水平

表6 CT对GEC自噬蛋白水平的影响

2.6CT对GEC Col-I 和 TGF-β1蛋白水平的影响:与NR组相比,HG组GEC Col-I、TGF-β1蛋白水平显著升高(P<0.05);与HG组相比,L-CT组、M-CT组、H-CT组Col-I、TGF-β1蛋白水平显著下降(P<0.05);SIRT1-IN-1 组较H-CT组 Col-I、TGF-β1蛋白水平上升(P<0.05),见图4,表7。

图4 Western blot检测Col-I 、TGF-β1蛋白水平

表7 CT对Col-I TGF-β1蛋白水平的影响

2.7CT对GEC Sirt1/FoxO1通路蛋白水平的影响:与NR组相比,HG组GEC p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平显著降低(P<0.05);与HG组相比,L-CT组、M-CT组、H-CT组 p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平显著升高(P<0.05);SIRT1-IN-1 组较H-CT组p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平降低(P<0.05),见图5,表8。

图5 Western blot检测GEC Sirt1、FoxO1蛋白水平

表8 CT对Sirt1/FoxO1通路蛋白水平的影响

3 讨 论

近年来,DM发病率持续上升,2015年全球共有4.15亿人被诊断患有DM[1]。DN是糖尿病的常见并发症,改善高糖诱导的GEC损伤是治疗DN的有效途径[3]。研究发现CT通过激活内质网应激介导的自噬抑制HCT116结直肠癌细胞的生长[6]。Lo等[7]发现CT可减轻I型糖尿病大鼠的心脏纤维化。近期发现,CT在抗糖尿病和抗肥胖方面起到改善作用[3]。因此,本研究猜测CT是否可以对高糖诱导的GEC损伤产生影响。

据报道,高葡萄糖通过促进线粒体中ROS的过度产生而引起氧化应激[8]。此外,过量生成的TNF-α、IL-6和IL-8被认为是高糖条件下导致DN组织损伤和纤维化的重要原因[3]。纤维化相关因子如Col-I和TGF-β1参与肾间质纤维化[9]。在正常血糖水平下,自噬是GEC的重要保护机制。自噬机制的下调,如在高血糖状态下,可促进DN的发展和进展[10]。研究发现坦索罗辛可以抑制TNF-α、IL-6、IL-8含量以及Col-I和TGF-β1的表达,减轻高糖诱导的GEC损伤[3]。本研究结果显示,与NR组相比,HG组OD570值、SOD含量、Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平显著下降,GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、Col-I、TGF-β1蛋白水平,IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量显著上调,CT处理后GEC增殖活性、自噬蛋白显著升高,炎性反应、氧化应激及维化因子蛋白水平显著下降,暗示CT可以激活高糖诱导的GEC自噬,减轻GEC炎性损伤以及氧化应激损伤。

SIRT1是NAD+依赖性脱乙酰酶的成员,内皮细胞中的SIRT1缺乏会促进氧化应激、炎症,SIRT1也是自噬的促进剂,FoxO1是一种转录因子,涉及一系列细胞内功能,包括自噬、线粒体功能障碍和细胞凋亡[11]。Xu等[5]发现上调Sirt1/FoxO1信号轴可以缓解DM大鼠肾损伤。本研究结果显示,与NR组相比,HG组p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平显著降低,而CT使p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平显著上调,暗示CT可以通过激活Sirt1/FoxO1信号轴激活细胞自噬以及细胞凋亡,进而缓解高糖诱导的GEC炎性损伤以及氧化应激损伤。本研究用Sirt1/FoxO1信号轴抑制剂和CT共同处理GEC,结果发现SIRT1-IN-1逆转了CT对GEC的有利作用。

综上所述,CT可以通过上调Sirt1/FoxO1信号轴激活自噬,减轻高糖诱导的炎性损伤、氧化应激损伤。本文不足是研究机制较浅,我们将在下步实验深入研究。